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Publicação
Saccharification of hemicellulose and cellulose with immobilized enzymes
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Autores
Orientador(es)
Resumo(s)
Wine is a very appreciated beverage worldwide, and, in Portugal, the winemaking sector is of major
socio-economic significance, substantially contributing to the national economy. However, it results in
a lot of residual material called pomace, which is rich in cellulose, hemicellulose, and lignin.
Cellulose and hemicellulose represent a significant portion of vegetal biomass, usually discarded as
feed. However, both sugar polymers can be hydrolyzed into C5 and C6 monomers by a saccharification
process and then fermented into multiple added-value products, like bioethanol.
The greener and more specific option for saccharification is through enzymes. However, after the
reaction is over, the enzymes are inactivated and remain in the final product, as there is no way to retrieve
them from the solution. Nonetheless, these enzymes are expensive and still functional after a single use.
So, this work’s goal is to develop immobilization protocols for cellulases and hemicellulases. That will
allow for their reuse, making the process economically more viable.
The immobilization protocols consisted of covalent attachment of cellulase to magnetic nanoparticles
(mNPs), specifically superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPIONs), and of hemicellulase to
chitosan microparticles (CMPs). SPIONs were used with multiple coatings – dimercaptosuccinic acid
(DMSA), (3-aminopropyl)triethoxysilane (APTES), and chitosan. With this approach, the enzymes
attached to the supports can be recovered by magnetic separation (for mNPs) or by filtration (for CMPs).
This work aims at the saccharification of subcritical water (SBW) pretreated Red Wine Grape Pomace
(RWGP). SBW results in a solid residue rich in lignin and cellulose, target of the cellulase complexes,
and a liquor rich in hemicellulose oligomers, target of the hemicellulase complexes. The target
characteristics for the complexes are reusability, high enzyme loading, and enzymatic activity, as well
as operational and storage stability. Therefore, the complexes were assessed by their retained activity
when comparing with the enzyme in its free form. The monomer yield was determined by
High-Performance Liquid Chromatography (HPLC), while enzyme leaching was monitored through
protein detection assays. A preliminary assessment of the complexes’ storage stability was also made.
To develop the immobilization protocols, the project started with the characterization of three available
commercial carbohydrase formulations and the analysis of their activity in their free form to establish a
control to compare to the immobilization complexes. Two cellulases, CelluClast 1.5L and Cellic cTec2,
and a hemicellulase, Viscozyme L, were tested. Protein content was determined by the Bradford assay
using Bovine Serum Albumin (BSA) as standard, resulting in 54.8 mg/mL for CelluClast 1.5L,
99.1 mg/mL for Cellic cTec2, and 20.6 mg/mL for Viscozyme L. Total saccharification activities of
51 units/mL in CClast and 137 units/mL in cTec2 were determined for the cellulases. An equivalent
activity measurement was determined for the hemicellulase Viscozyme L using two standard substrates,
achieving an activity of 2 units/mL in xylan and 0.4 units/mL in arabinogalactan.
Fifteen complexes were performed for the immobilization of cellulase onto mNPs, and two for
hemicellulase onto CMPs (HM). From the produced cellulase complexes, the CAS protocols (cellulase
immobilized onto APTES-coated SPIONs) were deemed less promising due to the loss of integrity of
the matrix. The most promising protocols for cellulase are CDS-g 0, a version of cellulase immobilized
onto DMSA-coated SPIONs, and CMm (cellulase immobilized onto CMPs with magnetic cores), while
for hemicellulase the most promising protocol is HM 2 (the 2nd protocol of hemicellulase immobilization
onto CMPs). However, they all must be reproduced in larger quantities and re-tested in multiple
saccharification cycles.
O vinho é uma bebida mundialmente apreciada e, em Portugal, a vitivinicultura é um sector muito importante a nível socioeconómico, contribuindo substancialmente para a economia nacional. No entanto, este resulta numa grande quantidade de material residual, intitulado de massas vínicas e rico em celulose, hemicelulose e lenhina. A celulose e a hemicelulose representam uma fracção significativa da biomassa vegetal, geralmente descartada como ração. No entanto, ambos estes polímeros podem ser hidrolisados atéa os respectivos monómeros (açúcares C5 e C6) por um processo de sacarificação, e em seguida fermentados a múltiplos produtos de valor acrescentado, entre eles bioetanol. Para a sacarificação, a opção mais “verde” e que oferece maior especificidade é o uso de enzimas, onde após a reação, as enzimas são inactivadas e permanecem no produto. No entanto, essas enzimas são dispendiosas e ainda funcionais após um único uso. Assim, o objectivo deste trabalho é desenvolver protocolos de imobilização para celulases e hemicelulases para possibilitar a sua reutilização, tornando o processo economicamente mais viável. Os protocolos de imobilização consistiram na ligação covalente de celulase a nanopartículas magnéticas (mNPs), especificamente nanopartículas superparamagnéticas de óxido de ferro (SPIONs), e também de hemicelulase a micropartículas de quitosano (CMPs). Através desta abordagem, após a sacarificação as enzimas fixadas podem ser recuperadas por separação magnética para as mNPs, ou por filtração no caso das CMPs. Para os SPIONs, diversos revestimentos – ácido dimercaptosuccínico (DMSA), (3-aminopropil)trietoxisilano (APTES), e quitosano – foram testados. O objectivo final dos complexos desenvolvidos neste trabalho será a sacarificação de massas vínicas de vinho tinto, as quais foram pré-tratadas através de um processo de autohidrólise (SBW). O resultado desse processo é um resíduo sólido rico em lignina e celulose, alvo dos complexos de celulase, e um licor rico em oligómeros de hemicelulose, para uso dos complexos de hemicelulase. As características alvo dos complexos são reutilizabilidade, alta carga e actividade enzimática, bem como estabilidade operacional e de armazenamento. Portanto, os complexos foram avaliados pela sua actividade retida, quando comparados com a enzima na sua forma livre. O rendimento de produção de monómeros foi determinado por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), enquanto a lixiviação da enzima foi monitorizada por métodos de detecção de proteínas em solução. A avaliação preliminar da estabilidade de armazenamento dos complexos foi também realizada. Previamente foi necessária a caracterização de três soluções comerciais disponíveis de carbohidrolases e a análise da sua actividade na forma livre, de modo a estabelecer um controlo para comparar com os complexos. Duas celulases, CelluClast 1.5L e Cellic cTec2, e uma hemicelulase, Viscozyme L, foram testadas. O conteúdo de proteína foi determinado pelo método de Bradford usando albumina de soro bovino (BSA) como padrão, e resultando em 54,8 mg/mL para CelluClast 1.5L, 99,1 mg/mL para Cellic cTec2 e 20,6 mg/mL para Viscozyme L. Foram determinadas atividades de sacarificação total de 51 unidades/mL em CClast e 137 unidades/mL em cTec2 para as celulases. Uma medição equivalente de actividade foi determinada para a hemicelulase Viscozyme L usando dois substratos padrão, alcançando- se uma actividade de 2 unidades/mL em xilano e 0,4 unidades/mL em arabinogalactano. Foram produzidos quinze complexos para a imobilização de celulase em mNPs, e dois para HM (hemicelulase em CMPs). Dos complexos de celulase, seguindo os protocolos CAS (celulase imobilizada em SPIONs revestidas com APTES) são menos promissores devido à perda de integridade da matriz. Os mais promissores são CDS-g0, uma versão de celulase imobilizada em SPIONs revestidas com DMSA, e CMm (celulase imobilizada em CMPs com núcleos magnéticos), enquanto que para hemicelulase o mais promissor é o HM 2 (o segundo complexo de imobilização de hemicelulase em CMPs). No entanto, todos estes devem ser reproduzidos em quantidades superiores, e testados novamente em múltiplos ciclos de sacarificação.
O vinho é uma bebida mundialmente apreciada e, em Portugal, a vitivinicultura é um sector muito importante a nível socioeconómico, contribuindo substancialmente para a economia nacional. No entanto, este resulta numa grande quantidade de material residual, intitulado de massas vínicas e rico em celulose, hemicelulose e lenhina. A celulose e a hemicelulose representam uma fracção significativa da biomassa vegetal, geralmente descartada como ração. No entanto, ambos estes polímeros podem ser hidrolisados atéa os respectivos monómeros (açúcares C5 e C6) por um processo de sacarificação, e em seguida fermentados a múltiplos produtos de valor acrescentado, entre eles bioetanol. Para a sacarificação, a opção mais “verde” e que oferece maior especificidade é o uso de enzimas, onde após a reação, as enzimas são inactivadas e permanecem no produto. No entanto, essas enzimas são dispendiosas e ainda funcionais após um único uso. Assim, o objectivo deste trabalho é desenvolver protocolos de imobilização para celulases e hemicelulases para possibilitar a sua reutilização, tornando o processo economicamente mais viável. Os protocolos de imobilização consistiram na ligação covalente de celulase a nanopartículas magnéticas (mNPs), especificamente nanopartículas superparamagnéticas de óxido de ferro (SPIONs), e também de hemicelulase a micropartículas de quitosano (CMPs). Através desta abordagem, após a sacarificação as enzimas fixadas podem ser recuperadas por separação magnética para as mNPs, ou por filtração no caso das CMPs. Para os SPIONs, diversos revestimentos – ácido dimercaptosuccínico (DMSA), (3-aminopropil)trietoxisilano (APTES), e quitosano – foram testados. O objectivo final dos complexos desenvolvidos neste trabalho será a sacarificação de massas vínicas de vinho tinto, as quais foram pré-tratadas através de um processo de autohidrólise (SBW). O resultado desse processo é um resíduo sólido rico em lignina e celulose, alvo dos complexos de celulase, e um licor rico em oligómeros de hemicelulose, para uso dos complexos de hemicelulase. As características alvo dos complexos são reutilizabilidade, alta carga e actividade enzimática, bem como estabilidade operacional e de armazenamento. Portanto, os complexos foram avaliados pela sua actividade retida, quando comparados com a enzima na sua forma livre. O rendimento de produção de monómeros foi determinado por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), enquanto a lixiviação da enzima foi monitorizada por métodos de detecção de proteínas em solução. A avaliação preliminar da estabilidade de armazenamento dos complexos foi também realizada. Previamente foi necessária a caracterização de três soluções comerciais disponíveis de carbohidrolases e a análise da sua actividade na forma livre, de modo a estabelecer um controlo para comparar com os complexos. Duas celulases, CelluClast 1.5L e Cellic cTec2, e uma hemicelulase, Viscozyme L, foram testadas. O conteúdo de proteína foi determinado pelo método de Bradford usando albumina de soro bovino (BSA) como padrão, e resultando em 54,8 mg/mL para CelluClast 1.5L, 99,1 mg/mL para Cellic cTec2 e 20,6 mg/mL para Viscozyme L. Foram determinadas atividades de sacarificação total de 51 unidades/mL em CClast e 137 unidades/mL em cTec2 para as celulases. Uma medição equivalente de actividade foi determinada para a hemicelulase Viscozyme L usando dois substratos padrão, alcançando- se uma actividade de 2 unidades/mL em xilano e 0,4 unidades/mL em arabinogalactano. Foram produzidos quinze complexos para a imobilização de celulase em mNPs, e dois para HM (hemicelulase em CMPs). Dos complexos de celulase, seguindo os protocolos CAS (celulase imobilizada em SPIONs revestidas com APTES) são menos promissores devido à perda de integridade da matriz. Os mais promissores são CDS-g0, uma versão de celulase imobilizada em SPIONs revestidas com DMSA, e CMm (celulase imobilizada em CMPs com núcleos magnéticos), enquanto que para hemicelulase o mais promissor é o HM 2 (o segundo complexo de imobilização de hemicelulase em CMPs). No entanto, todos estes devem ser reproduzidos em quantidades superiores, e testados novamente em múltiplos ciclos de sacarificação.
Descrição
Palavras-chave
Enzyme immobilization Cellulase Hemicellulase Magnetic nanoparticles Chitosan microparticles Lignocellulose saccharification