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Publicação
Novel Protein Conjugates for Targeted Delivery of Cytotoxic Metal Complexes for Cancer Theranostics
| Nome: | Descrição: | Tamanho: | Formato: | |
|---|---|---|---|---|
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Autores
Orientador(es)
Resumo(s)
This thesis focused on evaluating novel theranostic agents combining Gold-based cytotoxic com-
plexes with imaging tags attached to targeting biomolecules, such as antibodies or miniproteins, for a
theranostic approach. A miniprotein and antibody targeting PD-L1 were conjugated with a maleimide
reagent containing a DBCO group. The “alkyne-proteins” reacted with a symmetric Au(I) complex func-
tionalized with two azides. This resulted in the formation of bioconjugates featuring a Gold complex with
a terminal N3, which was explored to conjugate additional vectors such as a radiochelator or fluorophore.
Protein conjugation with excess of reagents (5-20 eq.) for 1-2 h at 25 ºC was confirmed by ESI-MS
analysis or fluorescence SDS-PAGE.
Cytotoxicity assays with the miniprotein bearing the “clicked-Gold-N3” complex showed an IC50 of
0.35 μM in A20 cells and 0.33 μM in MC38 cells, which is comparable to the activity of the original
complex (0.78 μM in A20 and 0.35 μM in MC38).
The “clicked-Gold-N3” miniprotein was further reacted with BCN-NODAGA, and the resulting bio-
conjugate radiolabeled with Gallium-67, with high radiochemical purity (95%) using relatively low protein
concentration and mild conditions (30 M, 30 min reaction at 37 °C). Cell studies demonstrated a sig-
nificant uptake in PD-L1-expressing cells (~10% uptake/mg of protein), with higher uptake observed at
37 °C compared to 25 °C, suggesting an active binding. Blocking experiments with the unmodified pro-
tein (10 μM) resulted in a minimal decrease in uptake, which does not strongly support receptor-medi-
ated binding. Biodistribution revealed selective accumulation of the 67Ga-miniprotein in “A20 PD-L1-
tumors” (2.71 ± 0.64 Injected Activity/g of tissue, 4h p.i.), with some off-target uptake in organs like liver
(29.79 I.A./g), blood (7.49 I.A./g), lungs (4.17 I.A./g), and spleen (5.12 I.A./g).
A similar strategy was employed to conjugate a fluorophore to Atezolizumab. In-gel fluorescence
confirmed successful labeling of the antibody. In vivo fluorescent imaging showed an increasing tumor
accumulation from 1h to 24h post-injection in mice bearing A20 tumors.
Esta tese centra-se na avaliação de novos agentes teranósticos que combinam complexos cito- tóxicos à base de ouro com sondas para imagem ligados a biomoléculas alvo, tais como anticorpos ou miniproteínas, para uma abordagem teranóstica.Uma miniproteína e anticorpo específicos para o PD- L1 foram conjugados com um reagente de maleimida que contém um grupo DBCO rígido. As proteínas contendo alcinos reagiram com um complexo de Au(I) simétrico contendo dois grupos azida. Isto resul- tou na formação de bioconjugados com um complexo de ouro com um grupo N3 terminal para incorporar vetores adicionais nas proteínas, tais como um agente quelante ou um fluoróforo. A modificação das proteínas após reação com excesso de reagentes (5-20 eq.) durante 1-2h a 25 °C foi confirmada por análise ESI-MS ou SDS-PAGE de fluorescência. Os ensaios de citotoxicidade com a miniproteína que contém o complexo Gold-N3 para “click chemistry” mostraram que a proteína apresentava um IC50 de 0.35 μM em células A20 e 0.33 μM em células MC38, o que é comparável à atividade do complexo original não conjugado (0.78 μM em A20 e 0.35 μM em MC38). A miniproteína Gold-N3 para “click chemistry” reagiu com o agente quelante BCN-NODAGA, e o bioconjugado resultante foi radiomarcado com Gálio-67 com elevada pureza radioquímica (95%) utili- zando-se concentrações relativamente baixas da proteína em condições suaves (30 μM, 30 min de reação a 37 °C). Os estudos em células demonstraram uma acumulação significativa nas células que expressam PD-L1 (~10% de absorção/mg de proteína), com valores mais elevados a 37 °C em com- paração com 25 °C, sugerindo um mecanismo ativo de ligação. Experiências de bloqueio com proteína não modificada (10 μM) resultaram apenas numa diminuição mínima da captação, o que não apoia o mecanismo de ligação mediado pelo recetor. Os estudos de biodistribuição revelaram uma acumulação seletiva da 67Ga-miniproteína em tumores que expressam PD-L1 (2.71 ± 0.64 Atividade injetada/g de tecido, 4h p.i.), com alguma captação fora do alvo em órgãos como o fígado (29.79 A.I./g), sangue (7.49 A.I./g), pulmões (4.17 A.I./g) e baço (5.12 A.I./g) às 4h p.i.. Foi utilizada uma estratégia semelhante para conjugar um fluoróforo com o Atezolizumab. A SDS-PAGE confirmou a marcação bem-sucedida do anticorpo. A imagiologia de fluorescência in vivo mostrou uma acumulação tumoral crescente entre a 1h e as 24h após a injeção em ratinhos inoculados com tumores A20.
Esta tese centra-se na avaliação de novos agentes teranósticos que combinam complexos cito- tóxicos à base de ouro com sondas para imagem ligados a biomoléculas alvo, tais como anticorpos ou miniproteínas, para uma abordagem teranóstica.Uma miniproteína e anticorpo específicos para o PD- L1 foram conjugados com um reagente de maleimida que contém um grupo DBCO rígido. As proteínas contendo alcinos reagiram com um complexo de Au(I) simétrico contendo dois grupos azida. Isto resul- tou na formação de bioconjugados com um complexo de ouro com um grupo N3 terminal para incorporar vetores adicionais nas proteínas, tais como um agente quelante ou um fluoróforo. A modificação das proteínas após reação com excesso de reagentes (5-20 eq.) durante 1-2h a 25 °C foi confirmada por análise ESI-MS ou SDS-PAGE de fluorescência. Os ensaios de citotoxicidade com a miniproteína que contém o complexo Gold-N3 para “click chemistry” mostraram que a proteína apresentava um IC50 de 0.35 μM em células A20 e 0.33 μM em células MC38, o que é comparável à atividade do complexo original não conjugado (0.78 μM em A20 e 0.35 μM em MC38). A miniproteína Gold-N3 para “click chemistry” reagiu com o agente quelante BCN-NODAGA, e o bioconjugado resultante foi radiomarcado com Gálio-67 com elevada pureza radioquímica (95%) utili- zando-se concentrações relativamente baixas da proteína em condições suaves (30 μM, 30 min de reação a 37 °C). Os estudos em células demonstraram uma acumulação significativa nas células que expressam PD-L1 (~10% de absorção/mg de proteína), com valores mais elevados a 37 °C em com- paração com 25 °C, sugerindo um mecanismo ativo de ligação. Experiências de bloqueio com proteína não modificada (10 μM) resultaram apenas numa diminuição mínima da captação, o que não apoia o mecanismo de ligação mediado pelo recetor. Os estudos de biodistribuição revelaram uma acumulação seletiva da 67Ga-miniproteína em tumores que expressam PD-L1 (2.71 ± 0.64 Atividade injetada/g de tecido, 4h p.i.), com alguma captação fora do alvo em órgãos como o fígado (29.79 A.I./g), sangue (7.49 A.I./g), pulmões (4.17 A.I./g) e baço (5.12 A.I./g) às 4h p.i.. Foi utilizada uma estratégia semelhante para conjugar um fluoróforo com o Atezolizumab. A SDS-PAGE confirmou a marcação bem-sucedida do anticorpo. A imagiologia de fluorescência in vivo mostrou uma acumulação tumoral crescente entre a 1h e as 24h após a injeção em ratinhos inoculados com tumores A20.
Descrição
Palavras-chave
ADCs SPDCs Gold complex target drug delivery theranostic