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Publicação
AAV2 capsid fusion of large proteins by rational design: Insertion sites breakdown
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Resumo(s)
Gene Therapy is one of the most extensively studied therapeutic modalities in both preclinical and clinical contexts and have shown efficacy in treating a wide range of diseases. Adeno-associated virus (AAV) is a commonly used viral vector in gene therapy due to its capability to safely and efficiently deliver therapeutic genes to target cells. Despite its success, AAV vector’s effectiveness can be enhanced through modifications to its capsid, the protein shell that protects the viral genome, by improving transduction, altering tropism, and reducing immune responses. Capsid engineering, particularly the insertion of larger proteins, remains an area of active research to further expand AAV vector's therapeutic potential. This technique requires separating the capsid viral proteins (VP1, VP2, and VP3) expression to allow for precise protein insertions into the AAV vector capsid sites. Despite previous studies, there is still a need to understand how these insertions affect the functionality of proteins over 20 kDa and the functionality of the vector capsid.
In this study we evaluated the insertion of mCherry protein (~28kDa) into three specific regions of the AAV2 capsid (residues 453 and 587 in VP1, and the N-terminal residue 138 in VP2), using four capsid mosaic constructs. We successfully validated these constructs by transient transfection, where insertion sites presented between a 15 and 148-fold decrease in mCherry-positive cells compared to the control. Following this, the engineered AAV2/mCherry mosaic vectors were produced and characterized by assessing their total particles, viral genome and transducing titers. No major losses in total particles and viral genome particles per mL were observed compared to the WT AAV2 vector control. Nevertheless, in terms of transducing units, there was a more prominent decrease in titers than in the control. Additionally, the effects of mCherry insertion on the AAV2 vector capsid's performance were evaluated in vitro. In VP1 insertion at the 453 residue, we observed that the mCherry peak was at 48 hours with almost 20% of mCherry positive cells. In VP2, results presented the highest value at 24 hours, with around 75% of mCherry positive cells maintaining the signal at 48 hours. This, overall, indicated a 4-fold difference in the mCherry signal between insertion sites in VP1 and VP2.
These findings allowed for a comparison of the three different insertion sites and their impact on overall AAV2 vector functionality and protein expression, indicating that the best hotspot for insertion of proteins ≥20kDa is residue 138 followed by 453 residue. This work lays the groundwork for the development of more effective AAV-based vectors, advancing gene therapy and expanding its potential to treat a wider range of genetic disorders.
A terapia génica é uma das modalidades terapêuticas mais investigadas, tanto no contexto pré-clínico como clínico, e tem-se revelado eficaz no tratamento de uma diversificada gama de doenças. O vírus adeno-associado (AAV) é um vetor viral amplamente utilizado na terapia génica devido à sua capacidade de fornecer genes terapêuticos às células-alvo de forma segura e eficiente. Apesar do seu sucesso, a eficácia do AAV pode ser melhorada através de modificações na sua cápside, o invólucro proteico que protege o genoma viral, melhorando a transdução, alterando o tropismo e reduzindo as respostas imunitárias. A engenharia da cápside, em particular a inserção de proteínas , continua a ser uma área de investigação ativa para expandir ainda mais o potencial terapêutico do vetor AAV. Esta técnica requer a separação das proteínas da cápside viral (VP1, VP2 e VP3) para permitir a inserção precisa de proteínas na cápside do AAV. Apesar de estudos anteriores, ainda há necessidade de compreender como estas inserções afetam quer a funcionalidade destas proteínas com mais de 20 kDa quer a funcionalidade da capsíde do vetor. Neste estudo, foi testada a inserção de uma proteína mCherry (~28kDa) em três regiões diferentes da cápside do vetor AAV2 (resíduos 453 e 587 na VP1, e o resíduo N-terminal 138 na VP2), usando quatro construções de mosaico da cápside. As construções foram validadas com êxito por transfecção transiente. Observou-se que a mcherry na cápside apresentava uma diminuição de intensidade 15 a 148 vezes nas células positivas para mCherry, em comparação com o controlo (mCherry livre). Em seguida, os vetores mosaicos AAV2/mCherry foram produzidos e caracterizados através da avaliação das suas partículas totais, genoma viral e títulos de transdução. Não foram observadas perdas significativas nas partículas totais e nas partículas do genoma viral por mL em comparação com o controlo do vetor WT AAV2. No entanto, nas unidades de transdução, verificou-se uma diminuição mais proeminente dos títulos em comparação com o controlo. Adicionalmente, os efeitos da inserção de mCherry no desempenho da cápside do vetor AAV2 foram avaliados in vitro. Na inserção da VP1 no resíduo 453, foi observado que o pico de percentagem de células mCherry positivas ocorreu às 48 horas com quase 20% de células positivas para mCherry. Na VP2, os resultados apresentaram o valor mais alto às 24 horas, com cerca de 75% das células positivas para mCherry mantendo o sinal às 48 horas. No geral, isto indicou uma diferença de 4 vezes no sinal mCherry entre os locais de inserção em VP1 e VP2. Estes resultados permitiram comparar três locais diferentes de inserção na cápside e o seu impacto na funcionalidade da proteína heteróloga e no vetor AAV2, indicando que o melhor local para a inserção de proteínas ≥20kDa é o resíduo 138, seguido do resíduo 453. Este trabalho estabelece as bases para o desenvolvimento de vetores de AAVs mais eficazes, fazendo avançar a terapia génica e expandindo o seu potencial para tratar uma gama mais vasta de doenças genéticas.
A terapia génica é uma das modalidades terapêuticas mais investigadas, tanto no contexto pré-clínico como clínico, e tem-se revelado eficaz no tratamento de uma diversificada gama de doenças. O vírus adeno-associado (AAV) é um vetor viral amplamente utilizado na terapia génica devido à sua capacidade de fornecer genes terapêuticos às células-alvo de forma segura e eficiente. Apesar do seu sucesso, a eficácia do AAV pode ser melhorada através de modificações na sua cápside, o invólucro proteico que protege o genoma viral, melhorando a transdução, alterando o tropismo e reduzindo as respostas imunitárias. A engenharia da cápside, em particular a inserção de proteínas , continua a ser uma área de investigação ativa para expandir ainda mais o potencial terapêutico do vetor AAV. Esta técnica requer a separação das proteínas da cápside viral (VP1, VP2 e VP3) para permitir a inserção precisa de proteínas na cápside do AAV. Apesar de estudos anteriores, ainda há necessidade de compreender como estas inserções afetam quer a funcionalidade destas proteínas com mais de 20 kDa quer a funcionalidade da capsíde do vetor. Neste estudo, foi testada a inserção de uma proteína mCherry (~28kDa) em três regiões diferentes da cápside do vetor AAV2 (resíduos 453 e 587 na VP1, e o resíduo N-terminal 138 na VP2), usando quatro construções de mosaico da cápside. As construções foram validadas com êxito por transfecção transiente. Observou-se que a mcherry na cápside apresentava uma diminuição de intensidade 15 a 148 vezes nas células positivas para mCherry, em comparação com o controlo (mCherry livre). Em seguida, os vetores mosaicos AAV2/mCherry foram produzidos e caracterizados através da avaliação das suas partículas totais, genoma viral e títulos de transdução. Não foram observadas perdas significativas nas partículas totais e nas partículas do genoma viral por mL em comparação com o controlo do vetor WT AAV2. No entanto, nas unidades de transdução, verificou-se uma diminuição mais proeminente dos títulos em comparação com o controlo. Adicionalmente, os efeitos da inserção de mCherry no desempenho da cápside do vetor AAV2 foram avaliados in vitro. Na inserção da VP1 no resíduo 453, foi observado que o pico de percentagem de células mCherry positivas ocorreu às 48 horas com quase 20% de células positivas para mCherry. Na VP2, os resultados apresentaram o valor mais alto às 24 horas, com cerca de 75% das células positivas para mCherry mantendo o sinal às 48 horas. No geral, isto indicou uma diferença de 4 vezes no sinal mCherry entre os locais de inserção em VP1 e VP2. Estes resultados permitiram comparar três locais diferentes de inserção na cápside e o seu impacto na funcionalidade da proteína heteróloga e no vetor AAV2, indicando que o melhor local para a inserção de proteínas ≥20kDa é o resíduo 138, seguido do resíduo 453. Este trabalho estabelece as bases para o desenvolvimento de vetores de AAVs mais eficazes, fazendo avançar a terapia génica e expandindo o seu potencial para tratar uma gama mais vasta de doenças genéticas.
Descrição
Palavras-chave
Adeno-Associated Virus AAV vector Capsid engineering Gene Therapy mCherry