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Publicação
Uncovering the secrets of Geotalea uraniireducens: a study of key players in uranium bioremediation pathway
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Orientador(es)
Resumo(s)
The Geobacteraceae family has gained recognition for exhibiting remarkable respiratory versatility, which allow them to sustain their growth using different extracellular compounds (including hazardous metals) in contrast to conventional respiratory processes, in which soluble electron donors and acceptors are the protagonists. These extracellular electron transfer (EET) capabilities confer to bacteria the potential of creating impact on biotechnological applications, namely those related to the environment, such as bioremediation and bioenergy production. To optimize these applications, it is imperative to understand how this EET process occurs. Multiheme cytochromes, particularly periplasmic c-type triheme cytochromes, have been identified as essential components for EET mechanism. While significant progress has been made in the characterization of these components in G. sulfurreducens – the first Geobacteraceae bacterium with a sequenced genome and a genetic system developed – their characterization in other species remains unexplored.
This Thesis focuses on the study of the periplasmic triheme cytochromes family (PpcA, PpcB, PpcG, and PpcH), along with another cytochrome (Gura_0469) from Geotalea uraniireducens, an organism commonly found in uranium-contaminated environments that plays a key role in bioremediation by reducing the soluble hexavalent form of uranium (U(VI)) into less soluble forms (e.g., U(IV)). All cytochromes were successfully cloned and heterologously expressed in E. coli, although the expression of PpcH Gu is still in progress. PpcA Gu, PpcB Gu, PpcG Gu, and Gura_0469 were purified using two chromatographic steps and a detailed biochemical and biophysical characterization was performed on PpcA Gu and PpcB Gu. These cytochromes were characterized using UV-visible, NMR, and CD spectroscopy, enabling the determination of their heme core architecture, overall protein fold, reduction potential of each heme group, and intramolecular redox interactions network, as well as their secondary structural elements and thermal stability. Despite being structurally homologous to their counterparts from G. sulfurreducens, the results obtained indicate that they are functionally different. PpcA and PpcB from G. uraniireducens modulate their redox properties in such a way that all hemes exhibit similar reduction potential values at physiological pH. This suggests that the electron transfer does not require targeting a specific region of the protein, allowing an efficient uranium reduction by any of the heme groups.
A família Geobacteraceae tem ganho reconhecimento pela sua notável versatilidade respiratória, a qual lhes permite usar diferentes compostos extracelulares (incluindo metais perigosos) como aceitadores finais de eletrões, ao contrário do que acontece nos processos respiratórios convencionais, em que tanto o dador como o aceitador de eletrões são solúveis. Esta capacidade de fazer transferência extracelular de eletrões (TEE) confere às bactérias o potencial de serem aplicadas na área da biotecnologia, especialmente nas tecnologias relacionadas com o meio ambiente, como é o caso da biorremediação ou da produção de bioenergia. Para otimizar estas aplicações é fundamental compreender como o mecanismo de TEE funciona. Neste contexto, os citocromos multihémicos, particularmente os citocromos trihémicos periplasmáticos do tipo c foram identificados como componentes essenciais. Embora esses componentes já tenham sido extensivamente caracterizados em G. sulfurreducens – o primeiro organismo da família Geobacteraceae com o genoma sequenciado e um sistema genético desenvolvido – a sua caracterização em outras espécies é escassa e permanece inexplorada. Esta tese centra-se no estudo não só da família de citocromos trihémicos periplasmáticos (PpcA, PpcB, PpcG, e PpcH) bem como doutro citocromo trihémico (Gura_0469) de Geotalea uraniireducens, um organismo frequentemente encontrado em ambientes contaminados com urânio e que desempenha um papel chave na sua biorremediação; isto é, na redução da forma hexavalente solúvel do urânio (U(VI)) em formas menos solúveis (como o U(IV)). Todos os citocromos foram clonados com sucesso e expressos heterologamente em E. coli, com exceção do PpcH Gu que ainda está em fase preliminar de testes de expressão. Os restantes (PpcA Gu, PpcB Gu, PpcG Gu e Gura_0469) foram purificados através de duas etapas cromatográficas e uma caracterização bioquímica e biofísica detalhada foi ainda realizada nos citocromos PpcA Gu e PpcB Gu. Várias técnicas espectroscópicas, como a espectroscopia UV-visível, o NMR e o Dicroísmo Circular foram utilizadas, permitindo não só a determinação do arranjo estrutural da proteína, como também do potencial de redução de cada grupo hemo e das suas interações intramoleculares (redox e redox-Bohr). Os elementos de estrutura secundária que constituem a proteína e a sua estabilidade térmica foram também alvos de estudo. No geral, os resultados obtidos indicam que, apesar da homologia estrutural para com os citocromos trihémicos periplasmáticos de G. sulfurreducens, estes são funcionalmente distintos. Em G. uraniireducens, ambos os citocromos PpcA e PpcB modulam as suas propriedades redox de forma a que todos os hemos tenham valores de potencial de redução semelhantes a pH fisiológico. Isto sugere que a transferência de eletrões não requer o direcionamento a uma região específica da proteína, permitindo que o urânio seja eficientemente reduzido por qualquer um dos hemos.
A família Geobacteraceae tem ganho reconhecimento pela sua notável versatilidade respiratória, a qual lhes permite usar diferentes compostos extracelulares (incluindo metais perigosos) como aceitadores finais de eletrões, ao contrário do que acontece nos processos respiratórios convencionais, em que tanto o dador como o aceitador de eletrões são solúveis. Esta capacidade de fazer transferência extracelular de eletrões (TEE) confere às bactérias o potencial de serem aplicadas na área da biotecnologia, especialmente nas tecnologias relacionadas com o meio ambiente, como é o caso da biorremediação ou da produção de bioenergia. Para otimizar estas aplicações é fundamental compreender como o mecanismo de TEE funciona. Neste contexto, os citocromos multihémicos, particularmente os citocromos trihémicos periplasmáticos do tipo c foram identificados como componentes essenciais. Embora esses componentes já tenham sido extensivamente caracterizados em G. sulfurreducens – o primeiro organismo da família Geobacteraceae com o genoma sequenciado e um sistema genético desenvolvido – a sua caracterização em outras espécies é escassa e permanece inexplorada. Esta tese centra-se no estudo não só da família de citocromos trihémicos periplasmáticos (PpcA, PpcB, PpcG, e PpcH) bem como doutro citocromo trihémico (Gura_0469) de Geotalea uraniireducens, um organismo frequentemente encontrado em ambientes contaminados com urânio e que desempenha um papel chave na sua biorremediação; isto é, na redução da forma hexavalente solúvel do urânio (U(VI)) em formas menos solúveis (como o U(IV)). Todos os citocromos foram clonados com sucesso e expressos heterologamente em E. coli, com exceção do PpcH Gu que ainda está em fase preliminar de testes de expressão. Os restantes (PpcA Gu, PpcB Gu, PpcG Gu e Gura_0469) foram purificados através de duas etapas cromatográficas e uma caracterização bioquímica e biofísica detalhada foi ainda realizada nos citocromos PpcA Gu e PpcB Gu. Várias técnicas espectroscópicas, como a espectroscopia UV-visível, o NMR e o Dicroísmo Circular foram utilizadas, permitindo não só a determinação do arranjo estrutural da proteína, como também do potencial de redução de cada grupo hemo e das suas interações intramoleculares (redox e redox-Bohr). Os elementos de estrutura secundária que constituem a proteína e a sua estabilidade térmica foram também alvos de estudo. No geral, os resultados obtidos indicam que, apesar da homologia estrutural para com os citocromos trihémicos periplasmáticos de G. sulfurreducens, estes são funcionalmente distintos. Em G. uraniireducens, ambos os citocromos PpcA e PpcB modulam as suas propriedades redox de forma a que todos os hemos tenham valores de potencial de redução semelhantes a pH fisiológico. Isto sugere que a transferência de eletrões não requer o direcionamento a uma região específica da proteína, permitindo que o urânio seja eficientemente reduzido por qualquer um dos hemos.
Descrição
Palavras-chave
Electrogenic bacteria electron transfer multiheme c-type cytochromes redox characterization nuclear magnetic resonance (NMR)