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Publicação
Identification and Characterization of Novel Regulators of Mitotic Fidelity
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Orientador(es)
Resumo(s)
At each round of nuclear division, the faithful formation and segregation of chromosomes between the two daughter cells is of primary importance for the maintenance of genome integrity. This process, known as Mitosis, is crucial for the development and proper functioning of all organisms. The fidelity of Mitosis, in turn, depends on the meticulous execution of a sequence of key steps, where certain chromosome players such as cohesin, condensin, and topoisomerase II are already known to play essential roles. However, given the importance of this cell cycle stage, additional layers of regulation continue under investigation. Aberrant mitosis, caused by failure in any of the nuclear division events can lead to chromosome mis-segregation. The resulting genome instability may contribute to several human pathologies, including cancer, infertility, and developmental diseases. By conducting an RNAi-based genetic screen in Drosophila melanogaster early embryos, this project aimed to identify and characterize novel regulators of mitotic fidelity. The developed approach provided the opportunity to conduct a dual-focus investigation, uncovering genes required for accurate chromosome segregation (HDAC-6 and CG10077) and potential regulators of transcription inactivation during mitosis (Dp1, BigH1, and Pr-set7). Among the relevant candidates identified, the histone deacetylase HDAC-6 was further investigated. The RNAi-mediated depletion of HDAC-6 resulted in delayed and compromised nuclear divisions, characterized by a high frequency of non-disjunction and anaphase bridges, and an increase in chromosome metaphase area. Notably, segregation defects in the absence of HDAC-6 were also observed in larvae wing discs. Additionally, EGFP-tagged HDAC-6 strains revealed that HDAC-6 is excluded from chromatin during interphase but gains access to chromatin upon mitotic entry. Moreover, the mitotic defects caused by HDAC-6 depletion prompt a hyper-recruitment of the chromosome assembly factor Barren (condensin I subunit) at DNA bridges site. Altogether, these findings suggest a previously undescribed role for HDAC-6 in the fidelity of nuclear division, acting specifically on mitotic chromatin to ensure proper sister chromatid resolution. Elucidating the mechanisms by which HDAC-6 contributes to faithful chromosome segregation may provide new insights into the importance of post-translational modifications, in particular deacetylation, during mitosis. Furthermore, this investigation has the potential to uncover new sources of genome instability and their impact on disease development, thereby guiding new treatment strategies.
A cada ciclo de divisão nuclear, a correta formação e segregação de cromossomas entre as duas células filhas é de extrema importância para a manutenção da integridade do genoma. Este processo, conhecido por Mitose, é crucial para o desenvolvimento e funcionamento de todos os organismos. A fidelidade mitótica, por sua vez, depende da meticulosa execução de uma sequência de etapas-chave, onde reguladores como a coesina, a condensina e a topoisomerase II são conhecidos por desempenharem funções essenciais. No entanto, face à importância deste processo celular, novos reguladores continuam sob investigação. Na verdade, defeitos em qualquer um dos eventos que constituem a divisão mitótica podem originar incorreta segregação dos cromossomas. A instabilidade genómica resultante pode, por sua vez, contribuir para várias patologias humanas, incluindo cancro, infertilidade e doenças no desenvolvimento. Através da realização de um RNAi screen em embriões de Drosophila melanogaster, este projeto teve como objetivo identificar e caraterizar novos reguladores da fidelidade mitótica. A abordagem desenvolvida proporcionou a oportunidade de realizar uma investigação de duplo foco, identificando genes necessários para a precisa segregação cromossómica (HDAC-6 e CG10077), bem como potenciais reguladores da dinâmica transcricional durante a mitose (Dp1, BigH1 e Pr-set7). Entre os candidatos relevantes, a histona desacetilase HDAC-6 foi submetida a uma investigação mais detalhadamente. A depleção de HDAC-6 mediada por RNAi originou divisões nucleares prolongadas e comprometidas, caracterizadas por uma elevada frequência de pontes cromossómicas em anáfase e de não-disjunção de cromossomas, bem como um aumento da área dos cromossomas em metáfase. Notavelmente, defeitos de segregação na ausência de HDAC-6 também foram observados nas asas de larvas. Adicionalmente, as estirpes de HDAC-6 marcadas com EGFP revelaram que HDAC-6 é excluído da cromatina durante interfase, mas ganha acesso à mesma aquando da entrada mitótica. Além disso, os defeitos mitóticos causados pela depleção de HDAC-6 levaram a um hiper-recrutamento de Barren-EGFP (subunidade I da condensina) – um regulador essencial na formação cromossómicanas bridges de DNA em anáfase. Em conjunto, estes resultados sugerem a descoberta de um novo papel de HDAC-6 em manter a fidelidade da divisão nuclear, atuando especificamente na cromatina para assegurar a resolução adequada dos cromatídeos. A elucidação dos mecanismos pelos quais a HDAC-6 contribui para a segregação correta dos cromossomas pode fornecer novas informações sobre a importância das modificações pós-traducionais, em particular a desacetilação, durante a mitose. Além disso, esta investigação tem o potencial de revelar novas fontes de instabilidade genómica e o seu impacto no desenvolvimento de doenças, originando assim novas estratégias de tratamento.
A cada ciclo de divisão nuclear, a correta formação e segregação de cromossomas entre as duas células filhas é de extrema importância para a manutenção da integridade do genoma. Este processo, conhecido por Mitose, é crucial para o desenvolvimento e funcionamento de todos os organismos. A fidelidade mitótica, por sua vez, depende da meticulosa execução de uma sequência de etapas-chave, onde reguladores como a coesina, a condensina e a topoisomerase II são conhecidos por desempenharem funções essenciais. No entanto, face à importância deste processo celular, novos reguladores continuam sob investigação. Na verdade, defeitos em qualquer um dos eventos que constituem a divisão mitótica podem originar incorreta segregação dos cromossomas. A instabilidade genómica resultante pode, por sua vez, contribuir para várias patologias humanas, incluindo cancro, infertilidade e doenças no desenvolvimento. Através da realização de um RNAi screen em embriões de Drosophila melanogaster, este projeto teve como objetivo identificar e caraterizar novos reguladores da fidelidade mitótica. A abordagem desenvolvida proporcionou a oportunidade de realizar uma investigação de duplo foco, identificando genes necessários para a precisa segregação cromossómica (HDAC-6 e CG10077), bem como potenciais reguladores da dinâmica transcricional durante a mitose (Dp1, BigH1 e Pr-set7). Entre os candidatos relevantes, a histona desacetilase HDAC-6 foi submetida a uma investigação mais detalhadamente. A depleção de HDAC-6 mediada por RNAi originou divisões nucleares prolongadas e comprometidas, caracterizadas por uma elevada frequência de pontes cromossómicas em anáfase e de não-disjunção de cromossomas, bem como um aumento da área dos cromossomas em metáfase. Notavelmente, defeitos de segregação na ausência de HDAC-6 também foram observados nas asas de larvas. Adicionalmente, as estirpes de HDAC-6 marcadas com EGFP revelaram que HDAC-6 é excluído da cromatina durante interfase, mas ganha acesso à mesma aquando da entrada mitótica. Além disso, os defeitos mitóticos causados pela depleção de HDAC-6 levaram a um hiper-recrutamento de Barren-EGFP (subunidade I da condensina) – um regulador essencial na formação cromossómicanas bridges de DNA em anáfase. Em conjunto, estes resultados sugerem a descoberta de um novo papel de HDAC-6 em manter a fidelidade da divisão nuclear, atuando especificamente na cromatina para assegurar a resolução adequada dos cromatídeos. A elucidação dos mecanismos pelos quais a HDAC-6 contribui para a segregação correta dos cromossomas pode fornecer novas informações sobre a importância das modificações pós-traducionais, em particular a desacetilação, durante a mitose. Além disso, esta investigação tem o potencial de revelar novas fontes de instabilidade genómica e o seu impacto no desenvolvimento de doenças, originando assim novas estratégias de tratamento.