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Publicação
Specific detection of nucleic acids and/or other bioanalytes for point-of-care diagnosis of tropical diseases
| Nome: | Descrição: | Tamanho: | Formato: | |
|---|---|---|---|---|
| 3.96 MB | Adobe PDF |
Autores
Orientador(es)
Resumo(s)
Dengue (DENV), Chikungunya (CHIKV), and Zika (ZIKV) viruses present similar high-fever
symptoms, making them challenging to differentiate and potentially leading to serious complications
without early detection and treatment. Point-of-care (POC) diagnoses are crucial, especially in low and
middle-income countries where these viruses are prevalent. POC devices enclosing nucleic acid
isothermal amplification, are a faster alternative to the gold standard, Polymerase Chain Reaction,
simplifying the process, requiring lower and constant temperature, and providing accurate results for
early virus detection and proper treatment.
In this study, we developed a rapid DENV detection method using a centrifugal microfluidic
cartridge combined with isothermal Recombinase Polymerase Amplification (RPA). Two different optical
detection strategies were evaluated: (1) integrated lateral flow assay strip and (2) in bulk fluorescence
detection. This work proved the possibility of detection on the microfluidic cartridge by testing different
known concentrations of a synthetic dsDNA mix constituted of a complementary primer and a probe
specifically designed for the strip, displaying a limit of detection down to 0.54 nM with cartridge sample
processing. Furthermore, RPA optimization was conducted for both detection strategies. Successful
RPA off-chip amplification and on-chip signal detection of a synthetic cDNA representative of the three
prime untranslated region gene was achieved within 35 minutes. Using the lateral flow strip detection,
the results displayed a significant difference in mean grey value 39-fold higher for the 105 copies/mL
target compared to the negative control. RPA off-chip amplification for in-bulk fluorescence detection on-
chip was also achieved within 20 minutes, showing promising results as an alternative method of
detection, possibly allowing quantitative analysis. In the future, further optimization is required for full
integration of the assay and detection on the disc, and multiplexing could enhance capabilities, enabling
simultaneous ZIKV and CHIKV detection.
Overall, the first steps of a future centrifugal POC DENV detection device were successfully
achieved.
Os vírus Dengue (DENV), Chikungunya (CHIKV) e Zika (ZIKV) apresentam sintomas semelhantes de febre alta, tornando-os difíceis de diferenciar e potencialmente levando a complicações graves sem detecção e tratamento precoces. Os diagnósticos point-of-care (POC) são cruciais, especialmente em países de baixa e média renda onde esses vírus são predominantes. Os dispositivos POC que incluem amplificação isotérmica de ácido nucleico são uma alternativa mais rápida ao “gold standard”, “Polymerase Chain Reaction”, simplificando o processo, exigindo temperatura mais baixa e constante e fornecendo resultados precisos para detecção precoce de vírus e tratamento adequado. Neste estudo, foi desenvolvido um método rápido de teteção do vírus da dengue (DENV) usando um cartucho microfluídico centrífugo, e “Recombinase Polymerase Amplification” (RPA). Duas estratégias diferentes de deteção foram testadas: (1) uma tira de ensaio de fluxo lateral integrada e (2) deteção de fluorescência em “bulk”. Este estudo demonstrou a capacidade do cartucho microfluídico de detetar uma mistura sintética com um limite de deteção tão baixo quanto 0.54 nM. Posteriormente, procedemos a otimização do RPA, para ambas as estratégias de deteção, no qual obtivemos uma amplificação e deteção em apenas 35 minutos. Usando a detecção de faixa de fluxo lateral, os resultados exibiram uma diferença significativa no “grey mean value” 39 vezes superior para o alvo de 105 cópias/mL em comparação com o controlo negativo. A amplificação RPA fora do chip para detecção de fluorescência em massa no chip foi alcançada em 20 minutos, mostrando resultados promissores, possivelmente permitindo uma análise quantitativa. Como trabalho futuro, será necessária uma otimização adicional para a integração total do ensaio e da detecção no disco, e a multiplexação poderá aprimorar os recursos, permitindo a detecção simultânea dos vírus ZIKV e CHIKV. No geral, os primeiros passos de um futuro dispositivo centrífugo de detecção POC DENV foram alcançados com sucesso.
Os vírus Dengue (DENV), Chikungunya (CHIKV) e Zika (ZIKV) apresentam sintomas semelhantes de febre alta, tornando-os difíceis de diferenciar e potencialmente levando a complicações graves sem detecção e tratamento precoces. Os diagnósticos point-of-care (POC) são cruciais, especialmente em países de baixa e média renda onde esses vírus são predominantes. Os dispositivos POC que incluem amplificação isotérmica de ácido nucleico são uma alternativa mais rápida ao “gold standard”, “Polymerase Chain Reaction”, simplificando o processo, exigindo temperatura mais baixa e constante e fornecendo resultados precisos para detecção precoce de vírus e tratamento adequado. Neste estudo, foi desenvolvido um método rápido de teteção do vírus da dengue (DENV) usando um cartucho microfluídico centrífugo, e “Recombinase Polymerase Amplification” (RPA). Duas estratégias diferentes de deteção foram testadas: (1) uma tira de ensaio de fluxo lateral integrada e (2) deteção de fluorescência em “bulk”. Este estudo demonstrou a capacidade do cartucho microfluídico de detetar uma mistura sintética com um limite de deteção tão baixo quanto 0.54 nM. Posteriormente, procedemos a otimização do RPA, para ambas as estratégias de deteção, no qual obtivemos uma amplificação e deteção em apenas 35 minutos. Usando a detecção de faixa de fluxo lateral, os resultados exibiram uma diferença significativa no “grey mean value” 39 vezes superior para o alvo de 105 cópias/mL em comparação com o controlo negativo. A amplificação RPA fora do chip para detecção de fluorescência em massa no chip foi alcançada em 20 minutos, mostrando resultados promissores, possivelmente permitindo uma análise quantitativa. Como trabalho futuro, será necessária uma otimização adicional para a integração total do ensaio e da detecção no disco, e a multiplexação poderá aprimorar os recursos, permitindo a detecção simultânea dos vírus ZIKV e CHIKV. No geral, os primeiros passos de um futuro dispositivo centrífugo de detecção POC DENV foram alcançados com sucesso.
Descrição
Palavras-chave
Point-of-care Microfluidic device isothermal amplificatio RPA 3’UTR gene Dengue virus