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Publicação
HIV-based virus-like particles: design and evaluation as a targeted therapy tool
| Nome: | Descrição: | Tamanho: | Formato: | |
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| 2.37 MB | Adobe PDF |
Autores
Orientador(es)
Resumo(s)
Nanomedicine has emerged in recent years as a field aimed at surpassing the shortcomings of standard
medicine. Among the different types of nanoparticles (NPs), virus-like particles (VLPs) arise as promising
nanostructures comprised of assembled viral proteins that take structural cues from viruses whilst lack-
ing viral genetic material. Production of these platforms can be carried out in countless expression sys-
tems, namely insect cells and mammalian cells. VLPs are characterized by being modifiable, biocompat-
ible, capable of self-assembly, immunogenic, and able to cross cell membranes, and can therefore be
harnessed as vaccines, delivery platforms and carriers of imaging molecules. Antibody fragments, such
as single-chain variable fragments (scFv), have been widely studied as targeting moieties.
This thesis aimed to characterize and evaluate human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1)- based
VLPs that expresses on its surface a scFv derived from trastuzumab, an antibody against the human
epidermal growth factor receptor 2 (HER2). The design of these nanoplatforms will be used as a proof-
of-concept for their application as specific drug and/or imaging agents carriers. VLPs were produced by
transient transfection with a mammalian cell line, HEK-293T. After VLPs production, they were charac-
terized by Western Blot, which confirmed the presence of scFv from trastuzumab. The radiolabelling
tests showed that fac-[99mTc(CO)3(H2O)3]+ could be used for radiolabelling His-tagged VLPs and its sta-
bility and uptake in cellular lines were performed. Evaluation of VLP-HER2 binding was carried out by
ELISA. According to the results, HIV1-based VLPs have an extremely high affinity towards HER2 proteins.
Finally, cytotoxicity assays to ascertain the antiproliferative activity of VLPs were conducted in two breast
cancer cell lines, a HER2-overexpressing cell line (SK-BR-3) and a cell line that lacks HER2 overexpression
(MDA-MB-231). The VLPs do not appear to be cytotoxic, which is an important feature for targeted
delivery tools. Overall, this work set up a novel protocol to produce a modified HIV-1-based VLP that
can potentially be used as a targeted delivery platform for various targets in multiple diseases.
A nanomedicina surgiu recentemente como uma área destinada a ultrapassar as carências da medicina tradicional. Entre os diferentes tipos de nanopartículas, as partículas semelhantes a vírus (VLPs) surgem como plataformas promissoras, compostas por proteínas virais, contudo sem material genético viral. A produção destas plataformas pode ser efetuada em inúmeros sistemas de expressão, nomeadamente células de insetos e mamíferos. As VLPs caracterizam-se por serem modificáveis, biocompatíveis, capa- zes de automontagem, imunogénicas e capazes de atravessar as membranas celulares, podendo ser utilizadas como vacinas e sistemas de entrega de fármacos e/ou de agentes de imagem. Os fragmentos de anticorpos, tais como os fragmentos variáveis de cadeia simples (scFv), têm sido amplamente estu- dados como moléculas alvo. Esta tese teve como objetivo caraterizar e avaliar as VLPs do vírus da imunodeficiência humana tipo 1 (HIV-1) que foram modificadas com um scFv contra recetor do fator de crescimento epidérmico humano tipo 2 (HER2). A construção destas funcionará como prova de conceito para a sua aplicação como trans- portadores de fármacos e/ou agentes de imagem. A linha celular HEK-293T foi selecionada para a pro- dução de VLP através de transfeção transiente. A caraterização das VLPs foi efetuada por Western Blot, e estas apresentaram a proteína de interesse. As VLPs foram marcadas com tecnécio-99m tricarbonilo, e foram avaliadas in vitro. A avaliação da ligação VLP-HER2 foi efetuada por ELISA. De acordo com os resultados têm uma afinidade extremamente elevada com as proteínas HER2. Por fim, ensaios de cito- toxicidade foram realizados para verificar a atividade antiproliferativa das VLPs em duas linhas celulares, uma linha celular com sobreexpressão de HER2 (SK-BR-3) e uma linha celular sem sobreexpressão de HER2 (MDA-MB-231). As VLPs não aparentaram ser citotóxicas. Em termos gerais, este projeto estabe- leceu um novo protocolo para produzir VLP modificada baseada no HIV-1 que pode ser potencialmente utilizada como uma plataforma de entrega direcionada para vários alvos em várias doenças.
A nanomedicina surgiu recentemente como uma área destinada a ultrapassar as carências da medicina tradicional. Entre os diferentes tipos de nanopartículas, as partículas semelhantes a vírus (VLPs) surgem como plataformas promissoras, compostas por proteínas virais, contudo sem material genético viral. A produção destas plataformas pode ser efetuada em inúmeros sistemas de expressão, nomeadamente células de insetos e mamíferos. As VLPs caracterizam-se por serem modificáveis, biocompatíveis, capa- zes de automontagem, imunogénicas e capazes de atravessar as membranas celulares, podendo ser utilizadas como vacinas e sistemas de entrega de fármacos e/ou de agentes de imagem. Os fragmentos de anticorpos, tais como os fragmentos variáveis de cadeia simples (scFv), têm sido amplamente estu- dados como moléculas alvo. Esta tese teve como objetivo caraterizar e avaliar as VLPs do vírus da imunodeficiência humana tipo 1 (HIV-1) que foram modificadas com um scFv contra recetor do fator de crescimento epidérmico humano tipo 2 (HER2). A construção destas funcionará como prova de conceito para a sua aplicação como trans- portadores de fármacos e/ou agentes de imagem. A linha celular HEK-293T foi selecionada para a pro- dução de VLP através de transfeção transiente. A caraterização das VLPs foi efetuada por Western Blot, e estas apresentaram a proteína de interesse. As VLPs foram marcadas com tecnécio-99m tricarbonilo, e foram avaliadas in vitro. A avaliação da ligação VLP-HER2 foi efetuada por ELISA. De acordo com os resultados têm uma afinidade extremamente elevada com as proteínas HER2. Por fim, ensaios de cito- toxicidade foram realizados para verificar a atividade antiproliferativa das VLPs em duas linhas celulares, uma linha celular com sobreexpressão de HER2 (SK-BR-3) e uma linha celular sem sobreexpressão de HER2 (MDA-MB-231). As VLPs não aparentaram ser citotóxicas. Em termos gerais, este projeto estabe- leceu um novo protocolo para produzir VLP modificada baseada no HIV-1 que pode ser potencialmente utilizada como uma plataforma de entrega direcionada para vários alvos em várias doenças.
Descrição
Palavras-chave
Human Immunodeficiency Virus Type 1 (HIV-1)-Based Virus-Like-Particles Human Ep- idermal Growth Factor Receptor 2 (HER2) Single-Chain Variable Fragment (scFv) Targeted Therapy