Carbon monoxide-mediated microglial phagocytosis of live neurons – role of CO in microglial engulfment of neurons

Abstract

In the Central Nervous System, microglia are the immunocompetent cells that control inflammation. In response to certain stimuli, these cells can be activated and polarize towards a pro-inflammatory response. Microglia have the ability to phagocyte dead cells and toxic factors. The process of phagocytosis is regulated by several cell surface receptors. One of these receptors is CD200R, which is expressed by microglia and, by binding to the CD200 ligand expressed on neurons, elicit anti-inflammatory activity and modulate phagocytosis. In a scenario of exacerbated inflammation, microglia can phagocyte viable neurons, which enter in a programmed cell death process by phagocytosis, known as phagoptosis. Carbon monoxide (CO), a gas endogenously produced with anti- inflammatory and anti-apoptotic properties. Previous work by our group indicates that CO may also be important in modulating microglial phagocytosis of dead neurons under inflammatory conditions. Therefore, this work set out to evaluate what the role of CO in the microglial phagocytosis of live neurons is and whether CD200/CD200R signalling is involved. Engulfment of neurons by microglia was assessed by measuring co-localization of microglial BV-2 cell line and neuronal CAD cell line using flow cytometry. It was found that there was an increase of microglial engulfment of neurons after LPS treatment, indicating the activation of phagoptosis. In contrast when microglia were pre-treated with the CO-releasing molecule ALF-826, engulfment of live neurons was reverted. We evaluated whether CD200R was involved in this reversal by silencing this gene expression. Preliminary data indicates, that after silencing CD200R, LPS did not increase engulfment and there were no differences with CO pre-treatment. This data suggests that a lack of CD200/CD200R signalling may be protective against phagocytosis of live neurons. Finally, because peroxisomes are important organelles modulating inflammation and phagocytosis, we evaluated whether the anti-inflammatory action of CO involves these organelles. Three different BV-2 microglia cell lines were used, the wildtype (WT), a knockout of the ACOX-1 peroxisomal enzyme gene and a double knockout of the ABCD1 and ABCD2 peroxisome transporter genes. The integrity of the peroxisomes was assessed indirectly by lipid peroxidation using the thiobarbituric acid reaction (TBARs) assay. Preliminary data indicates that in the mutant strains there is a decrease of lipid peroxidation under inflammatory conditions.

No sistema nervoso central, as células imunocompetentes que despoletam a resposta inflamatória são as células da microglia. Estas células em respostas a determinados estímulos podem ser ativadas e polarizadas para uma resposta pró- inflamatória. A microglia têm a capacidade de fagocitar células mortas ou debris celular tóxico. O processo de fagocitose é regulado por sinalização por parte de recetores da superfície celular. Um destes recetores é o CD200R que é expresso pela microglia e em ligação com o ligando CD200, expresso por neurónios, tem atividade anti-inflamatória e modula a fagocitose. Em cenários de inflamação exagerada, a microglia pode fagocitar neurónios viáveis, que entram num processo de morte celular por fagocitose, a fagoptose. O monóxido de carbono (CO), um gás produzido endogenamente, já foi comprovado como uma molécula anti-inflamatória e anti-apoptótica. Trabalho prévio do grupo indica que o CO também seja importante na modulação da fagocitose microglial de neurónios mortos em condições de inflamação. Deste modo foi-se avaliar qual o papel do CO na fagocitose microglial de neurónios vivos e se o par CD200/CD200R está envolvido. O engulfment de neurónios pela microglia foi avaliado através de citometria de fluxo que permite medir a co localização de microglia BV-2 e neurónios CAD. Verificou- se que houve um aumento de engulfment após tratamento de LPS, mas que pré- tratamento com a CO-releasing molecule ALF-826 revertia este aumento. Avaliou-se se o CD200R estava envolvido nesta reversão ao fazer um silenciamento deste gene. Dados preliminares indicam que com silenciamento, o LPS não aumentou o engulfment e não se verificaram diferenças com pré-tratamento com CO. Estes dados sugerem que a falta de sinalização CD200/CD200R pode ser protetora contra a fagocitose de neurónios vivos. Por fim, como os peroxisomas são organelos importantes na regulação da inflamação e da fagocitose, foi-se avaliar se a ação anti-inflamatória do CO envolve estes organelos. Para tal utilizaram-se três linhas celulares de microglia BV-2, a linha wildtype, uma com knockout no gene do enzima peroxisomal ACOX-1 e outra com knockout duplo dos genes dos transportadores peroxisomais ABCD1 e ABCD2. Avaliou- se a integridade dos peroxisomas pela sua peroxidação lipídica através do ensaio da reação do ácido tiobarbitúrico (TBARs). Dados preliminares indicam que nas estirpes mutantes há uma diminuição da peroxidação lipídica em condições inflamatórias.