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Publicação
Biochemical and Biophysical Characterization of PHA Synthases from Pseudomonas mandelii
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Resumo(s)
The widespread use of petrochemical plastics has led to an unprecedented amount of plastic waste being accumulated contributing significantly to the global issue of plastic pollution. To address this problem, there is growing interest in seeking sustainable alternatives with biodegradable plastics, such as polyhydroxyalkanoates (PHAs). PHAs are synthesized by various microorganisms as carbon and energy storage compounds, with PHA synthase (PhaC) playing a central role in the polymerization process. This enzyme is classified in four different classes according to structural features and substrate specificity.
This thesis focused on characterizing PHA synthases from two different classes identified in the genome of Pseudomonas mandelii, aiming to provide a comprehensive understanding of their biochemical and biophysical attributes. This is crucial for determining and optimizing the physicochemical properties of the PHAs produced, which can be tailored based on the composition of monomers incorporated.
The full-length PhaCI and catalytic domains of PhaCs class I and II were overexpressed in E.coli BL21 and showed solubility in solution. In addition, we performed site-direct mutagenesis, targeting residues of the active site and the dimerization interface of PhaCI. The protein purification was optimized through chromatographic techniques, where PhaC exhibited improved protein stability in high ionic strength buffers, and the oligomerization state was determined. Full-length PhaCI was shown to predominantly exist as a dimer, while the truncated proteins showed a monomer-dimer equilibrium. Enzymatic assays confirmed that N-terminal domain of PhaCI is crucial for its function and the conserved catalytic triad (Asp-His-Cys) is essential for the activity.
Although unsuccessful crystallization assays, the PhaCI envelope in solution was assessed via SAXS batch experiments confirming the extended dimeric conformation. Complementary AlphaFold2 predictions provided further PhaC structural insights, particularly regarding the N-terminal conformation and its role on dimerization.
O uso extensivo de plásticos convencionais derivados de combustíveis fósseis tem gerado uma enorme quantidade de plásticos residuais, contribuindo significativamente para o problema ambiental de poluição por plásticos. De modo a combater esta questão, o interesse em alternativas sustentáveis, como os plásticos biodegradáveis, nomeadamente os polihidroxialcanoatos (PHAs), tem crescido significativamente. Os PHAs são sintetizados por vários microrganismos como reservas de carbono e energia, sendo a PHA sintase (PhaC) responsável por desempenhar um papel central no processo de polimerização de PHAs. Esta enzima é classificada em quatro classes diferentes consoante as suas características estruturais e especificidade aos substratos. Esta tese focou-se na caracterização de PHA sintases de duas classes diferentes identificadas no genoma de Pseudomonas mandelii, de modo a obter uma melhor compreensão em relação às características bioquímicas e biofísicas destas enzimas. Este estudo é importante para poder determinar e otimizar as propriedades físico-químicas dos PHAs produzidos, podendo essas ser ajustáveis com base na composição dos monómero incorporados. A PhaCI full-length e os domínios catalíticos das classes I e II de PhaC foram sobreexpressos em E. coli BL21 e apresentaram solubilidade em solução. Adicionalmente, recorremos a uma abordagem de mutagénese dirigida, considerando os aminoácidos envolvidos no centro catalítico e na superfície de dimerização da PhaCI. A purificação da proteína recombinante foi otimizada utilizando técnicas cromatográficas, em que mostrou ser mais estável em tampões com maior força iónica, e o estado de oligomerização foi determinado. Demonstrou-se que a PhaCI full-length existe predominantemente sob forma de dímero, enquanto as proteínas truncadas mostraram existir num equilíbrio de monómero-dímero. Os ensaios enzimáticos confirmaram que o domínio N-terminal da PhaCI é importante para a sua função e que a tríade catalítica conservada (Asp-His-Cys) é essencial para a atividade enzimática. Apesar dos ensaios de cristalização não terem sido bem-sucedidos, o envelope da PhaCI em solução foi obtido através de experiências de SAXS em batch, confirmando a conformação dímerica estendida da proteína. Em complementaridade, previsões do AlphaFold2 forneceram uma melhor compreensão estrutural da PhaC, especialmente em relação à conformação do N-terminal e o seu papel na dimerização.
O uso extensivo de plásticos convencionais derivados de combustíveis fósseis tem gerado uma enorme quantidade de plásticos residuais, contribuindo significativamente para o problema ambiental de poluição por plásticos. De modo a combater esta questão, o interesse em alternativas sustentáveis, como os plásticos biodegradáveis, nomeadamente os polihidroxialcanoatos (PHAs), tem crescido significativamente. Os PHAs são sintetizados por vários microrganismos como reservas de carbono e energia, sendo a PHA sintase (PhaC) responsável por desempenhar um papel central no processo de polimerização de PHAs. Esta enzima é classificada em quatro classes diferentes consoante as suas características estruturais e especificidade aos substratos. Esta tese focou-se na caracterização de PHA sintases de duas classes diferentes identificadas no genoma de Pseudomonas mandelii, de modo a obter uma melhor compreensão em relação às características bioquímicas e biofísicas destas enzimas. Este estudo é importante para poder determinar e otimizar as propriedades físico-químicas dos PHAs produzidos, podendo essas ser ajustáveis com base na composição dos monómero incorporados. A PhaCI full-length e os domínios catalíticos das classes I e II de PhaC foram sobreexpressos em E. coli BL21 e apresentaram solubilidade em solução. Adicionalmente, recorremos a uma abordagem de mutagénese dirigida, considerando os aminoácidos envolvidos no centro catalítico e na superfície de dimerização da PhaCI. A purificação da proteína recombinante foi otimizada utilizando técnicas cromatográficas, em que mostrou ser mais estável em tampões com maior força iónica, e o estado de oligomerização foi determinado. Demonstrou-se que a PhaCI full-length existe predominantemente sob forma de dímero, enquanto as proteínas truncadas mostraram existir num equilíbrio de monómero-dímero. Os ensaios enzimáticos confirmaram que o domínio N-terminal da PhaCI é importante para a sua função e que a tríade catalítica conservada (Asp-His-Cys) é essencial para a atividade enzimática. Apesar dos ensaios de cristalização não terem sido bem-sucedidos, o envelope da PhaCI em solução foi obtido através de experiências de SAXS em batch, confirmando a conformação dímerica estendida da proteína. Em complementaridade, previsões do AlphaFold2 forneceram uma melhor compreensão estrutural da PhaC, especialmente em relação à conformação do N-terminal e o seu papel na dimerização.
Descrição
Palavras-chave
Bioplastics Polyhydroxyalkanoate (PHA) PHA Synthase (PhaC) Pseudomonas mandelii Biochemical Characterization Biophysical Characterization