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Publicação
Studies on mycobacteria glycosyltransferases, promising targets to develop antituberculosis drugs
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|---|---|---|---|---|
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Autores
Orientador(es)
Resumo(s)
Tuberculosis (TB), caused by the pathogen Mycobacterium tuberculosis (Mtb) continues
to be a major infectious disease responsible for global mortality. Although treatment exists,
resistance to first- and second-line drugs is awell-knownglobal public health problem. The
emergence of multi- and extensive-drug resistant strains of Mtb reflects the urgent need to
develop newdrugs and effective treatment approaches. The success of Mtb is mostly due to
the complexity of its cellwall (CW) structure, well-known as themycolyl-arabino-galactanpeptidoglycan
(mAGP) complex. Arabinofuranosyltransferases (EmbA-C and AftA-D)
play a crucial role in the biosynthesis of arabinogalactan, being vital for mycobacterial
growth and survival. The biosynthesis of arabinogalactan presents some promising targets
for anti-TB drugs. The arabinosyl transferases Emb are inhibited by ethambutol (EMB), a
first-line antibiotic used to treat TB, therefore compromising CW integrity. Mutations in
the embB gene have been linked toEMBresistance, while Afts appear as newdistinct targets
for the creation of innovative TB treatments. Therefore, the main goal of this thesis was
the study of EmbB, AftA and AftD, to further understand their essentiality and their role
in mycobacterial fitness and drug resistance. First, knockdown mutants of embB, aftA and
aftD were generated in the bacterial study model, Mycobacterium smegmatis (M. smegmatis),
using the clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR) interference
(CRISPRi) system. CRISPRi is based on the anhydrotetracycline (ATc)-inducible expression
and relies on the small single guideRNA(sgRNA), that is specific to a target gene sequence,
together with the enzymatically inactive Cas9 (dCas9) protein. Using this system, embB
and aftA were confirmed to be essential in M. smegmatis, and the level of embB and aftA
knockdown seemed to be directly related with the strength of the associated proto-spacer
adjacent motif (PAM). The aftD knockdown mutant did not show any viability defect
phenotype and, for that reason, no further studies were carried out with this mutant. The
basal gene expression, the distance of the target gene region from the transcription start site
and the role of the target genes in the biosynthesis of arabinogalactan may also influence
CRISPRi-mediated gene silencing and, consequently, the associated phenotypes. The level
of knockdown was also assessed by quantitative real-time polymerase chain reaction (qRTPCR),
and a significant decrease in embB and aftA mRNA expression levelwas obtained, in agreement with previous reports, there was evidence of a downstream polar effect when
the aftA gene was silenced by CRISPRi. In this work, M. smegmatis competent cells were
also transformed with the pVVAP-AftA expression vector. A prediction of the structure
of AftA in Mtb was obtained using the artificial intelligence program AlphaFold and,
docking was performed to predict the complementarity of the protein binding sites with
several compounds, which were selected based on a drug repurposing strategy. A total of
four compounds were selected. The effectiveness of each compound against AftA from
M. smegmatis was assessed through minimum inhibitory concentration (MIC), minimum
bactericidal concentration (MBC) assays and growth curves. All the compounds tested
showed very high MIC values, except for compound A. This compound had a reasonable
MIC value and proved to be bactericidal. In parallel with the work performed with AftA,
this project at ITQB also aimed to purify and performed activity assays with the AftD
protein. Although, the protein purification attemptswere not successful, promising results
were obtained in the activity assays. The results of the activity assays were analyzed by
NMRspectroscopy, where the arabinofuranose transfer from 13C-labeled donor to acceptor
can be followed by changes of the chemical shifts on NMR 13C-spectrum.
A tuberculose (TB), causada pelo agente patogénico Mycobacterium tuberculosis (Mtb), continua a ser uma das principais doenças infeciosas responsável por milhões de mortes em todo o mundo. Embora a tuberculose seja uma doença infeciosa para a qual já existeum tratamento, a resistência aos medicamentos de primeira e segunda linha é um conhecido problema de saúde pública mundial. O aparecimento de estirpes de Mtb multi ou extensivamente resistentes, reflete a urgente necessidade de desenvolver novos medicamentos e abordagens de tratamento eficazes. O sucesso de Mtb deve-se sobretudo à complexidade da estrutura da sua parede celular (PC), comumente conhecida como o complexo micolilarabino- galactano-peptidoglicano (mAGP). As arabinofuranosiltransferases (EmbA-C e AftA-D) desempenham um papel crucial na biossíntese do arabinogalactano, sendo vital para o crescimento e sobrevivência das micobactérias. A biossíntese do arabinogalactano apresenta alguns alvos promissores para fármacos contra a TB. As arabinosiltransferases Emb são inibidas pelo etambutol (EMB), um antibiótico de primeira linha utilizado no tratamento da TB, comprometendo assim a integridade da PC. A resistência ao EMB tem sido associada a mutações no gene embB, enquanto as Afts parecem ser um novo alvo distinto para o desenvolvimento de novas terapêuticas para a TB. Desta forma, o principal objetivo desta tese de mestrado foi o estudo das arabinosiltransferases EmbB, AftA e AftD, para melhor compreender a sua essencialidade e função nas micobactérias. Primeiro, foram construídos mutantes knockdown dos genes embB, aftA e aftD no organismo de estudo Mycobacterium smegmatis (M. smegmatis), através de um sistema de interferência de repetições palindrómicas curtas regularmente espaçadas (CRISPRi). CRISPRi é um sistema que se baseia na expressão induzida pela anidrotetraciclina (ATc) e depende de um pequeno RNA guia (sgRNA), que será específico para uma sequência genética alvo, juntamente com a proteína Cas9 enzimaticamente inativa (dCas9). Através deste sistema confirmou-se que os genes embB e aftA são essenciais para a sobrevivência de M. smegmatis, e ainda que a eficiência do knockdown parece estar diretamente relacionada com a força do motivo adjacente ao proto-espaçador (PAM) associado. Os mutantes knockdown do gene aftD apresentaram um fenótipo de baixa viabilidade, por isso, não foram realizados mais estudos com estes mutantes. A expressão génica basal, a distância da região alvo do gene ao local de iniciação da transcrição e o papel dos genes alvo na biossíntese do arabinogalactano parecem também influenciar o silenciamento de genes mediado por CRISPRi e, consequentemente, os fenótipos associados. Os knockdowns foram ainda avaliados por uma reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (qRT-PCR), tendo-se obtido uma diminuição significativa do nível de expressão do mRNA de embB e aftA. Em concordância com estudos anteriores, houve evidência de um efeito polar a jusante quando o gene aftA foi silenciado através do sistema CRISPRi. Neste projeto, células competentes de M. smegmatis foram ainda transformadas com o vetor de expressão pVVAP-AftA. Para além disto, através de um programa de inteligência artificial designado AlphaFold, foi possível obter uma previsão da estrutura da AftA de Mtb. Assim sendo,um estudo de docking foi realizado para prever a complementaridade dos locais de ligação da proteína a possíves compostos. Quatro compostos foram, então, selecionados com base numa estratégia de reaproveitamento de fármacos. A eficiência de cada composto na ação da proteína AftA em M. smegmatis foi determinada através dos ensaios da concentração mínima inibitória (CMI), concentração bactericida mínima (CBM) e ainda através de curvas de crescimento. Todos os compostos testados demonstraram valores de CMI elevados, com a exceção do composto A. Além de apresentar um valor de CMI razoável, este composto mostrou ainda possuir atividade bactericida. Em paralelo com o trabalho realizado com a proteína AftA, este projeto no ITQB também tinha como objetivo purificar e realizar ensaios de atividade com a proteína AftD. Embora as tentativas de purificação da proteína não tenham sido bem sucedidas, foram obtidos resultados promissores nos ensaios de atividade. Os resultados dos ensaios de atividade foram analisados através de espectroscopia de 13C-RMN, onde as alterações nos espetros são observadas através de desvios químicos, uma vez que se trata de um espetro de carbono marcado, pois dador tem grupo arabinofuranosil marcado com 13C.
A tuberculose (TB), causada pelo agente patogénico Mycobacterium tuberculosis (Mtb), continua a ser uma das principais doenças infeciosas responsável por milhões de mortes em todo o mundo. Embora a tuberculose seja uma doença infeciosa para a qual já existeum tratamento, a resistência aos medicamentos de primeira e segunda linha é um conhecido problema de saúde pública mundial. O aparecimento de estirpes de Mtb multi ou extensivamente resistentes, reflete a urgente necessidade de desenvolver novos medicamentos e abordagens de tratamento eficazes. O sucesso de Mtb deve-se sobretudo à complexidade da estrutura da sua parede celular (PC), comumente conhecida como o complexo micolilarabino- galactano-peptidoglicano (mAGP). As arabinofuranosiltransferases (EmbA-C e AftA-D) desempenham um papel crucial na biossíntese do arabinogalactano, sendo vital para o crescimento e sobrevivência das micobactérias. A biossíntese do arabinogalactano apresenta alguns alvos promissores para fármacos contra a TB. As arabinosiltransferases Emb são inibidas pelo etambutol (EMB), um antibiótico de primeira linha utilizado no tratamento da TB, comprometendo assim a integridade da PC. A resistência ao EMB tem sido associada a mutações no gene embB, enquanto as Afts parecem ser um novo alvo distinto para o desenvolvimento de novas terapêuticas para a TB. Desta forma, o principal objetivo desta tese de mestrado foi o estudo das arabinosiltransferases EmbB, AftA e AftD, para melhor compreender a sua essencialidade e função nas micobactérias. Primeiro, foram construídos mutantes knockdown dos genes embB, aftA e aftD no organismo de estudo Mycobacterium smegmatis (M. smegmatis), através de um sistema de interferência de repetições palindrómicas curtas regularmente espaçadas (CRISPRi). CRISPRi é um sistema que se baseia na expressão induzida pela anidrotetraciclina (ATc) e depende de um pequeno RNA guia (sgRNA), que será específico para uma sequência genética alvo, juntamente com a proteína Cas9 enzimaticamente inativa (dCas9). Através deste sistema confirmou-se que os genes embB e aftA são essenciais para a sobrevivência de M. smegmatis, e ainda que a eficiência do knockdown parece estar diretamente relacionada com a força do motivo adjacente ao proto-espaçador (PAM) associado. Os mutantes knockdown do gene aftD apresentaram um fenótipo de baixa viabilidade, por isso, não foram realizados mais estudos com estes mutantes. A expressão génica basal, a distância da região alvo do gene ao local de iniciação da transcrição e o papel dos genes alvo na biossíntese do arabinogalactano parecem também influenciar o silenciamento de genes mediado por CRISPRi e, consequentemente, os fenótipos associados. Os knockdowns foram ainda avaliados por uma reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (qRT-PCR), tendo-se obtido uma diminuição significativa do nível de expressão do mRNA de embB e aftA. Em concordância com estudos anteriores, houve evidência de um efeito polar a jusante quando o gene aftA foi silenciado através do sistema CRISPRi. Neste projeto, células competentes de M. smegmatis foram ainda transformadas com o vetor de expressão pVVAP-AftA. Para além disto, através de um programa de inteligência artificial designado AlphaFold, foi possível obter uma previsão da estrutura da AftA de Mtb. Assim sendo,um estudo de docking foi realizado para prever a complementaridade dos locais de ligação da proteína a possíves compostos. Quatro compostos foram, então, selecionados com base numa estratégia de reaproveitamento de fármacos. A eficiência de cada composto na ação da proteína AftA em M. smegmatis foi determinada através dos ensaios da concentração mínima inibitória (CMI), concentração bactericida mínima (CBM) e ainda através de curvas de crescimento. Todos os compostos testados demonstraram valores de CMI elevados, com a exceção do composto A. Além de apresentar um valor de CMI razoável, este composto mostrou ainda possuir atividade bactericida. Em paralelo com o trabalho realizado com a proteína AftA, este projeto no ITQB também tinha como objetivo purificar e realizar ensaios de atividade com a proteína AftD. Embora as tentativas de purificação da proteína não tenham sido bem sucedidas, foram obtidos resultados promissores nos ensaios de atividade. Os resultados dos ensaios de atividade foram analisados através de espectroscopia de 13C-RMN, onde as alterações nos espetros são observadas através de desvios químicos, uma vez que se trata de um espetro de carbono marcado, pois dador tem grupo arabinofuranosil marcado com 13C.
Descrição
Palavras-chave
Tuberculosis Mycobacterial cell wall Arabinofuranosyltransferases Antibiotic resistance Drug repurposing