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Publicação
NO2Probe: Application of a new nitrite point-of-care test in biomedicine
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Resumo(s)
Periodontal disease (PD) results from the inflammatory response to the presence of bacterial biofilms. The disease progression goes through two phases: gingivitis, characterized by bleeding and gingiva gums swelling, and periodontitis, an aggravated condition that can lead to bone, gingival, and teeth loss. For diagnosis, time-consuming periodontal charts and X-rays are evaluated. Thus, it is convenient to recognize clinical biomarkers measuring each individual's PD occurrence and extent. The nitrite (NO2-) level in saliva has been pointed out in this regard, but it is not yet clinically used as a PD biomarker. Thus, the study objectives were to evaluate the relationship between PD and nitrite concentration in non-stimulated saliva samples, and the implementation of a new specific and sensitive biosensor, the NO2Probe, for nitrite quantification during the medical appointment.
The approach involved the screen-printed carbon electrodes (SPE) modification and optimization with the multihemic nitrite reductase enzyme (ccNiR), which catalyzes the direct reduction reaction of nitrite into ammonia. As an oxygen scavenging system, an ascorbate oxidase (AOx) layer was added and, finally, a polymer layer (PVA), to “delay” the ccNiR saturation. The amperometric biosensor (SPE/ccNiR/AOx/PVA) covers a linearity range between 5-300 μM, with a sensitivity of 0.015 μM-1. The obtained values were compared with the conventional Griess method. The biosensor was statistically validated.
Initially, the centrifugation and freezing steps of the samples were evaluated, evaluating the two methods, and verifying that, with the biosensor, centrifugation is not necessary. In the Griess method, centrifugation is essential, as the nitrite concentration in non-centrifuged samples (199 ± 3 μM) decreases after centrifugation (68.8 ± 0.5 μM). When frozen, the NO2- concentration decreases, probably due to the NO2- instability. It was concluded that samples should be analyzed fresh as soon as possible.
In the pilot study, carried out at the CiiEM Dental Clinic, it was not possible to establish a concrete relationship between the NO2- concentration and the disease stages and grades. Contrary to the expectations, the periodontally healthy group (n=11) had higher NO2- concentration (257 ± 30 μM) higher than those observed in the PD patients group (n=24).
A Doença Periodontal (PD) decorre da resposta inflamatória à presença de biofilmes bacterianos. A progressão desta, passa por duas fases: a gengivite, caracterizada pelo sangramento e inchaço da gengiva, e a periodontite, condição agravada que pode conduzir à perda de tecidos ósseo, gengival e de dentes. Para diagnóstico, são avaliados morosos periodontogramas e os raios-X. Assim, é conveniente o reconhecimento de biomarcadores clínicos aferindo a ocorrência e extensão da PD em cada indivíduo. O nível de nitrito (NO2-) na saliva, tem sido apontado nesse sentido, mas ainda não é utilizado clinicamente como biomarcador da PD. Assim, os objetivos foram: avaliar a relação entre a PD e a concentração de nitrito, em amostras de saliva não estimulada, e a implementação de um novo biossensor, o NO2Probe, específico e sensível para quantificação de nitrito durante a consulta. A abordagem passou pela modificação e otimização de elétrodos impressos de carbono (SPE) com a enzima multihémica redutase do nitrito (ccNiR), que catalisa a reação de redução direta do nitrito a amónia. Como sistema de remoção de oxigénio, adicionou-se uma camada de Ascorbato oxidase (AOx) e, finalmente, uma camada de polímero (PVA), para “atrasar” a saturação da ccNiR. O biossensor amperometrico (SPE/ccNiR/AOx/PVA) mostrou abranger uma gama de linearidade entre 5-300 μM, com sensibilidade de 0.015 μM-1. Os valores obtidos foram comparados com o método convencional de Griess. Estatisticamente, o biossensor foi validado. Inicialmente, foram avaliados os passos centrifugação e congelamento das amostras avaliando os dois métodos, verificando-se que, com o biossensor, não é necessário centrifugar amostras. Já pelo método de Griess, a centrifugação é fundamental, pois a concentração de nitrito em amostras não centrifugadas (199 ± 3 μM) decresce após centrifugação (68.8 ± 0.5 μM). Quando congeladas, há diminuição da concentração de nitrito, provavelmente devido à instabilidade deste. Concluiu-se que as amostras devem ser analisadas de fresco, o mais rápido possível. No estudo piloto, conduzido na Clínica Dentária do CiiEM, não foi possível estabelecer uma relação concreta entre a concentração de nitrito e os estadios e graus da doença. Contrariamente ao esperado, o grupo composto por indivíduos periodontalmente saudáveis (n=11), apresentaram concentrações de nitrito (257 ± 30 μM) superiores às verificadas no grupo de doentes (n=24).
A Doença Periodontal (PD) decorre da resposta inflamatória à presença de biofilmes bacterianos. A progressão desta, passa por duas fases: a gengivite, caracterizada pelo sangramento e inchaço da gengiva, e a periodontite, condição agravada que pode conduzir à perda de tecidos ósseo, gengival e de dentes. Para diagnóstico, são avaliados morosos periodontogramas e os raios-X. Assim, é conveniente o reconhecimento de biomarcadores clínicos aferindo a ocorrência e extensão da PD em cada indivíduo. O nível de nitrito (NO2-) na saliva, tem sido apontado nesse sentido, mas ainda não é utilizado clinicamente como biomarcador da PD. Assim, os objetivos foram: avaliar a relação entre a PD e a concentração de nitrito, em amostras de saliva não estimulada, e a implementação de um novo biossensor, o NO2Probe, específico e sensível para quantificação de nitrito durante a consulta. A abordagem passou pela modificação e otimização de elétrodos impressos de carbono (SPE) com a enzima multihémica redutase do nitrito (ccNiR), que catalisa a reação de redução direta do nitrito a amónia. Como sistema de remoção de oxigénio, adicionou-se uma camada de Ascorbato oxidase (AOx) e, finalmente, uma camada de polímero (PVA), para “atrasar” a saturação da ccNiR. O biossensor amperometrico (SPE/ccNiR/AOx/PVA) mostrou abranger uma gama de linearidade entre 5-300 μM, com sensibilidade de 0.015 μM-1. Os valores obtidos foram comparados com o método convencional de Griess. Estatisticamente, o biossensor foi validado. Inicialmente, foram avaliados os passos centrifugação e congelamento das amostras avaliando os dois métodos, verificando-se que, com o biossensor, não é necessário centrifugar amostras. Já pelo método de Griess, a centrifugação é fundamental, pois a concentração de nitrito em amostras não centrifugadas (199 ± 3 μM) decresce após centrifugação (68.8 ± 0.5 μM). Quando congeladas, há diminuição da concentração de nitrito, provavelmente devido à instabilidade deste. Concluiu-se que as amostras devem ser analisadas de fresco, o mais rápido possível. No estudo piloto, conduzido na Clínica Dentária do CiiEM, não foi possível estabelecer uma relação concreta entre a concentração de nitrito e os estadios e graus da doença. Contrariamente ao esperado, o grupo composto por indivíduos periodontalmente saudáveis (n=11), apresentaram concentrações de nitrito (257 ± 30 μM) superiores às verificadas no grupo de doentes (n=24).
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Palavras-chave
Periodontal disease Nitrite Point-of-care test Biosensors