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Publicação
A molecular view on how a commensal bacterium thrives in the human gut
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Resumo(s)
The human gut contains a community of commensal bacteria, named gut microbiota, which are essential to breakdown the dietary polysaccharides indigestible by humans, by producing carbohydrate-active enzymes (CAZymes). The Bacteroidetes phylum possess polysaccharide utilization loci (PUL) that code for CAZymes, along with other proteins responsible for transport and uptake of dietary polysaccharides and host-derived glycans. The CAZymes are usually associated with non-catalytic ancillary modules, nominated carbohydrate-binding modules (CBMs), important for targeting carbohydrates. Multiple CAZymes and CBMs are still not well characterized and require further structural and functional studies.
The main goal of the work reported in this thesis was to structurally characterize three putative family 32 CBMs identified in the genome of Bacteroides caccae, a member of the gut microbiota. These putative CBM32s are the non-catalytic ancillary modules found in glycoside hydrolases family 31 (BC03580) and in peptidases from the M60-like family (BC16100-C and BC07535-C). A preliminary three-dimensional (3D) structure of BC03580 (PUL 22) was solved by X-ray crystallography at a resolution of 2.97Å, revealing multiple regions of disordered electron density. In addition, the 3D structures of BC16100-C from PUL 53 and BC16100-C bound to GalNAc were obtained with a resolution of 1.67Å and 1.6Å, respectively. A prediction of the 3D structure of BC07535-C (PUL 35) was also modelled using the machine-learning approach of AlphaFold2. The comparison with a characterized CBM32, BT3015-C, revealed the conservation of a -sandwich fold in the three putative CBM32s and a lack of conservation of some amino acids belonging to the putative binding site in BC16100-C and BC07535-C. This could result in different modes of binding to their respective carbohydrates ligands, Tn and core 1 and core 2 O-glycans. These results pave the way to an increased knowledge on the function of these important modules and their influence in the action of the enzyme partners.
O trato gastrointestinal do ser humano é habitado pela microbiota instestinal, uma comunidade de bactérias comensais, que degrada os polissacáridos ingeridos que o ser humano não consegue digerir, através de enzimas ativas para hidratos de carbono (CAZymes). O filo Bacteroidetes contém os Polysaccharide utilization loci (PULs) que codificam, não só as CAZymes, mas também outras proteínas que realizam o transporte e absorção de hidratos de carbono ingeridos e provenientes do hospedeiro. As CAZymes estão associadas a módulos auxiliares não-catalíticos, nomeados de módulos de ligação a hidratos de carbono (CBMs), essenciais para o reconhecimento dos açúcares. Dado o seu potencial biotecnológico, torna-se importante a caracterização funcional e estrutural das CAZymes e dos CBMs. O objetivo principal desta dissertação foi caracterizar estruturalmente três CBMs putativos da família 32, identificados no genoma de um dos membros da microbiota intestinal, Bacteroides caccae. Estes CBM32s putativos estão associados a hidrolases glicosídicas da família 31 (BC03580) e a peptidases da família M60 (BC16100-C e BC07535-C). Obteve-se uma estrutura preliminar 3D do CBM32 putativo BC03580 (PUL 22) com uma resolução de 2.97Å, através da cristalografia de raios-X, revelando regiões com densidade eletrónica desordenada, e as estruturas 3D de BC16100-C (PUL 53) e BC16100-C ligado a GalNAc com uma resolução de 1.67Å e 1.6Å, respetivamente. Realizou-se uma previsão da estrutura 3D de BC07535-C (PUL 35) usando o AlphaFold2. Comparando com outro CBM32 já caracterizado, BT3015-C, observou-se que o enrolamento em -sandwich é conservado nos três CBM32s putativos. No entanto, alguns aminoácidos que pertencem ao local de ligação putativo aparentam não ser conservados nos CBM32s BC16100-C e BC07535-C, podendo levar a diferentes modos de ligação aos seus respetivos ligandos, Tn e O-glicanos core 1 e core 2. Estes resultados são importantes para adquirir mais conhecimento sobre a função destes módulos e sua influência na ação dos parceiros enzimáticos.
O trato gastrointestinal do ser humano é habitado pela microbiota instestinal, uma comunidade de bactérias comensais, que degrada os polissacáridos ingeridos que o ser humano não consegue digerir, através de enzimas ativas para hidratos de carbono (CAZymes). O filo Bacteroidetes contém os Polysaccharide utilization loci (PULs) que codificam, não só as CAZymes, mas também outras proteínas que realizam o transporte e absorção de hidratos de carbono ingeridos e provenientes do hospedeiro. As CAZymes estão associadas a módulos auxiliares não-catalíticos, nomeados de módulos de ligação a hidratos de carbono (CBMs), essenciais para o reconhecimento dos açúcares. Dado o seu potencial biotecnológico, torna-se importante a caracterização funcional e estrutural das CAZymes e dos CBMs. O objetivo principal desta dissertação foi caracterizar estruturalmente três CBMs putativos da família 32, identificados no genoma de um dos membros da microbiota intestinal, Bacteroides caccae. Estes CBM32s putativos estão associados a hidrolases glicosídicas da família 31 (BC03580) e a peptidases da família M60 (BC16100-C e BC07535-C). Obteve-se uma estrutura preliminar 3D do CBM32 putativo BC03580 (PUL 22) com uma resolução de 2.97Å, através da cristalografia de raios-X, revelando regiões com densidade eletrónica desordenada, e as estruturas 3D de BC16100-C (PUL 53) e BC16100-C ligado a GalNAc com uma resolução de 1.67Å e 1.6Å, respetivamente. Realizou-se uma previsão da estrutura 3D de BC07535-C (PUL 35) usando o AlphaFold2. Comparando com outro CBM32 já caracterizado, BT3015-C, observou-se que o enrolamento em -sandwich é conservado nos três CBM32s putativos. No entanto, alguns aminoácidos que pertencem ao local de ligação putativo aparentam não ser conservados nos CBM32s BC16100-C e BC07535-C, podendo levar a diferentes modos de ligação aos seus respetivos ligandos, Tn e O-glicanos core 1 e core 2. Estes resultados são importantes para adquirir mais conhecimento sobre a função destes módulos e sua influência na ação dos parceiros enzimáticos.
Descrição
Palavras-chave
commensal bacteria gut microbiota Polysaccharide utilization loci CBM32 X-ray crystallography