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Publicação
Plasmonic Nanostars for Sensitive SERS-based Immunodetection
| Nome: | Descrição: | Tamanho: | Formato: | |
|---|---|---|---|---|
| 5.28 MB | Adobe PDF |
Autores
Orientador(es)
Resumo(s)
Malaria remains a global health problem and detection is essential to combat this disease. Rapid
diagnostic tests in a lateral flow assay (LFA) format using Plasmodium falciparum histidine-rich pro-
tein II (PfHRPII) as biomarker is the most common malaria detection method. These LFAs are usually
low-cost and rapid but suffer from low sensitivity. Surface-enhanced Raman scattering (SERS) is a
technique with high sensitivity and combined with LFA, is possible to detect PfHRPII through colori-
metric and SERS assays, increasing the limits of detection. The recombinant antigen PfHRPII was
expressed using a vector containing a His-tag in Escherichia coli and purified by a Ni-NTA column.
The SDS-PAGE and western blot confirmed the presence of PfHRPII with a molecular weight of 67
kDa (at 0.12 ± 0.03 mg∙mL-1
). The SERS tags were developed with star-shaped gold nanoparticles
functionalised with a Raman reporter, 4-mercaptobenzoic acid, and covalently conjugated with an
antibody. A proof-of-concept was made with Peroxidase/anti-Peroxidase complex with bovine serum
albumin to block unspecific interactions and the SERS tags formation and activity were fully charac-
terised through UV-Vis spectra, agarose gel electrophoresis, enzymatic activity assay, and dynamic
light scattering. Each component of LFA was evaluated by the pixel intensity difference between the
background and test line by ImageJ. The LFA optimisations led to the selection of a nitrocellulose
membrane (CNPF8) not blocked, a sample pad (GFB-R7L), and an absorbent pad (AP-045). Anti-
Peroxidase (0.9 mg∙mL-1
) and anti-IgG (0.5 mg∙mL-1
) were immobilised on the test and control lines,
respectively. The sample was mixed into the SERS tags at 0.2 nM and deposited in the sample pad.
The LOD and LOQ were determined as 5.24 and 7.28 μg∙mL-1
, respectively. Lastly, an LFA was in-
cubated with recombinant PfHRPII at 50 ng∙mL-1 and the SERS performance was compared with a
negative control (no PfHRPII). The samples had a small but significant difference nevertheless further
studies are needed to reduce the non-specific interactions from the control sample.
A malária continua a ser um problema de saúde global e a sua deteção é essencial para combater a doença. O método de deteção de malária mais comum é o teste de diagnóstico rápido em formato de teste de fluxo lateral (conhecido pelo acrónimo de LFA) usando como biomarcador a proteína rica em histidina II de Plasmodium falciparum (PfHRPII). Estes LFAs são de baixo custo e rápidos, oferecem pouca sensibilidade. Espectroscopia de Raman aumentada pela superfície (conhecida pelo acrónimo de SERS) é uma técnica com grande sensibilidade e quando combinada com LFA, pode detetar PfHRPII por análise colorimétrica e por SERS, aumentando os limites de deteção. O antigénio recom- binante PfHRPII foi expresso em Escherichia coli usando um vetor e purificado por uma coluna de níquel (Ni-NTA) através da cauda de histidinas. As técnicas SDS-PAGE e western blot confirmaram a presença de PfHRPII com um peso molecular de 67 kDa (a 0,12 ± 0,03 mg∙mL-1 ). As sondas de SERS foram produzidas com nanopartículas de ouro em formato de estrela, funcionalizadas com um repórter de Raman, o ácido 4-mercaptobenzóico, e conjugado covalentemente com um anticorpo. Através do complexo da enzima peroxidase/anti-peroxidase, e com albumina de soro bovino para bloquear intera- ções inespecíficas, foi feito uma prova de conceito e a formação e a atividade das sondas de SERS foram caracterizadas através de espectro de UV-Vis, eletroforese em gel de agarose, ensaio de ativida- de enzimática e dispersão dinâmica de luz. Todos os componentes de LFA foram avaliados pela dife- rença de intensidade de pixel entre o fundo e a linha de teste por ImageJ. As otimizações de LFA per- mitiram a seleção da membrana de nitrocelulose (CNPF8) não bloqueada, do bloco de amostra (GFB- R7L), e do bloco absorvente (AP-045). O anticorpo anti-peroxidase (0,9 mg∙mL-1 ) e o anti-IgG (0,5 mg∙mL-1 ) foram imobilizados nas linhas de teste e controlo, respetivamente. A amostra foi misturada nas sondas de SERS a 0,2 nM e depositadas no bloco de amostra. O LOD e o LOQ foram determina- dos como 5,24 e 7,28 μg∙mL-1 , respetivamente. Por último, um LFA foi incubado com PfHRPII re- combinante a 50 ng∙mL-1 e o desempenho de SERS foi comparado com o controlo negativo (sem PfHRPII). As amostras tiveram uma pequena, mas significativa diferença, no entanto, são necessários mais estudos para reduzir as interações não específicas na amostra de controlo.
A malária continua a ser um problema de saúde global e a sua deteção é essencial para combater a doença. O método de deteção de malária mais comum é o teste de diagnóstico rápido em formato de teste de fluxo lateral (conhecido pelo acrónimo de LFA) usando como biomarcador a proteína rica em histidina II de Plasmodium falciparum (PfHRPII). Estes LFAs são de baixo custo e rápidos, oferecem pouca sensibilidade. Espectroscopia de Raman aumentada pela superfície (conhecida pelo acrónimo de SERS) é uma técnica com grande sensibilidade e quando combinada com LFA, pode detetar PfHRPII por análise colorimétrica e por SERS, aumentando os limites de deteção. O antigénio recom- binante PfHRPII foi expresso em Escherichia coli usando um vetor e purificado por uma coluna de níquel (Ni-NTA) através da cauda de histidinas. As técnicas SDS-PAGE e western blot confirmaram a presença de PfHRPII com um peso molecular de 67 kDa (a 0,12 ± 0,03 mg∙mL-1 ). As sondas de SERS foram produzidas com nanopartículas de ouro em formato de estrela, funcionalizadas com um repórter de Raman, o ácido 4-mercaptobenzóico, e conjugado covalentemente com um anticorpo. Através do complexo da enzima peroxidase/anti-peroxidase, e com albumina de soro bovino para bloquear intera- ções inespecíficas, foi feito uma prova de conceito e a formação e a atividade das sondas de SERS foram caracterizadas através de espectro de UV-Vis, eletroforese em gel de agarose, ensaio de ativida- de enzimática e dispersão dinâmica de luz. Todos os componentes de LFA foram avaliados pela dife- rença de intensidade de pixel entre o fundo e a linha de teste por ImageJ. As otimizações de LFA per- mitiram a seleção da membrana de nitrocelulose (CNPF8) não bloqueada, do bloco de amostra (GFB- R7L), e do bloco absorvente (AP-045). O anticorpo anti-peroxidase (0,9 mg∙mL-1 ) e o anti-IgG (0,5 mg∙mL-1 ) foram imobilizados nas linhas de teste e controlo, respetivamente. A amostra foi misturada nas sondas de SERS a 0,2 nM e depositadas no bloco de amostra. O LOD e o LOQ foram determina- dos como 5,24 e 7,28 μg∙mL-1 , respetivamente. Por último, um LFA foi incubado com PfHRPII re- combinante a 50 ng∙mL-1 e o desempenho de SERS foi comparado com o controlo negativo (sem PfHRPII). As amostras tiveram uma pequena, mas significativa diferença, no entanto, são necessários mais estudos para reduzir as interações não específicas na amostra de controlo.
Descrição
Palavras-chave
Lateral Flow Assay Plasmodium falciparum Histidine-Rich Protein II Surface- Enhanced Raman Scattering Surface-Enhanced Raman Scattering Tags Malaria