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Publicação
Spectroscopic and kinetic characterization of YhjA, a bacterial peroxidase from Escherichia coli
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Resumo(s)
Non-classical bacterial peroxidases have only recently been isolated and characterized. YhjA, a non-classical bacterial peroxidase from E. coli was the focus of this work. This enzyme has a predicted transmembrane helix and is proposed to receive electrons from the quinone pool, in an electron transfer pathway involving three haems to accomplish the reduction of hydrogen peroxide in the periplasm.
YhjA WT and YhjA M125A variant (mutation on the proposed distal axial ligand of the NT haem) were produced homologously in E. coli C41 (DE3)/pET28a_yhjA WT or M125A to obtain the full-length YhjA, or E. coli C41 (DE3)/pET22b_yhjA WT or M125A to obtain the soluble form of YhjA. Full-length YhjA was produced for the first time, with purity ratios (A407nm/A280nm) of 0.7 and 1.4 for YhjA WT and YhjA M125A variant, respectively. The full-length YhjA WT and YhjA M125A variant were characterized using UV-visible spectroscopy, displaying the characteristic Soret and Q-bands. A preliminary steady-state kinetic assessment using ABTS2-, as artificial electron donor, revealed that both YhjA WT and M125A variant were catalytically active. The spectroscopic characterization of soluble YhjA demonstrated differences between YhjA WT and YhjA M125A variant, in the UV-visible spectra, as the NT-haem of YhjA M125A variant is high-spin and probably has a lower reduction potential; CD demonstrated that YhjA M125A is thermodynamically more unstable than YhjA WT, with a lower TM (43 ºC vs 49 ºC). Michaelis-Menten curves were obtained for both YhjA WT and M125A variant, in the oxidized and mixed-valence states, with YhjA WT having the highest estimated value for KM (15.4 ± 0.8 mM), while the lowest KM is for YhjA WT in the mixed-valence state (9.2 ± 0.4 mM). Ligand binding studies followed by UV-visible titrations, together with kinetic experiments, using azide and imidazole revealed that YhjA has a higher affinity for imidazole. The latter binds in a two-step mechanism, unlike azide. Both compounds display a mixed competitive/non-competitive inhibition mechanism. This work provided knowledge in the involvement of the NT haem in the catalytic mechanism and provided evidence of YhjA’s inhibition using azide and imidazole, being the starting point for the identification of drugs that can be used to inhibit this enzyme.
As peroxidases bacterianas não clássicas só recentemente foram isoladas e caracterizadas. YhjA, uma peroxidase bacteriana não clássica de E. coli foi o foco deste trabalho. O modelo estrutural desta enzima prevê uma hélice transmembranar, que permitirá receber eletrões das quinonas, segundo uma via de transferência de eletrões que envolve três hemos, e assim reduzir o peróxido de hidrogénio no periplasma. A YhjA WT e a variante YhjA M125A (mutação no ligando distal axial proposto do hemo NT) foram produzidas de forma homóloga em E. coli C41 (DE3)/pET28a_yhjA WT ou M125A para obter a forma nativa da YhjA, ou E. coli C41 ( DE3)/pET22b_yhjA WT ou M125A para obter a forma solúvel da YhjA. A forma nativa da YhjA foi produzida pela primeira vez, com razões de pureza (A407nm/A280nm) de 0,7 e 1,4 para a YhjA WT e a variante YhjA M125A, respetivamente. A YhjA WT e a variante YhjA M125A foram caracterizadas utilizando espectroscopia de UV-visível, exibindo as bandas de Soret e Q características. Estudos cinéticos preliminares, em condições de estado estacionário utilizando ABTS2- como doador artificial de eletrões, revelaram que tanto a YhjA WT como a variante M125A são cataliticamente ativas. A caracterização espectroscópica da YhjA solúvel demonstrou diferenças entre a YhjA WT e a variante YhjA M125A, nos espetros de UV-visível, sendo que o hemo NT da variante encontra-se num estado high-spin, e provavelmente terá um potencial de redução inferior; por CD demonstrou-se que a variante YhjA M125A é termodinamicamente mais instável que a YhjA WT, com uma menor TM (43 ºC vs 49 ºC). As curvas de Michaelis-Menten foram obtidas para a YhjA WT e a variante M125A, nos estados oxidada e valência-mista, sendo que a YhjA WT tem o maior valor estimado para KM (15,4 ± 0,8 mM), enquanto que o menor KM estimado foi para a YhjA WT no estado de valência mista (9,2 ± 0,4 mM). Estudos de ligação seguidos por titulações UV-visíveis, juntamente com cinética de inibição, utilizando azida e imidazol, revelaram que a YhjA tem uma maior afinidade para o imidazol. Este liga-se num mecanismo que envolve duas etapas, ao contrário da azida. Ambos os compostos apresentam um mecanismo misto de inibição competitiva/não-competitiva. Este trabalho contribui com conhecimento sobre o envolvimento do hemo NT no mecanismo catalítico e forneceu evidências da inibição da YhjA utilizando azida e imidazol, sendo o ponto de partida para a identificação de novos compostos terapêuticos que possam ser usados para inibir esta enzima.
As peroxidases bacterianas não clássicas só recentemente foram isoladas e caracterizadas. YhjA, uma peroxidase bacteriana não clássica de E. coli foi o foco deste trabalho. O modelo estrutural desta enzima prevê uma hélice transmembranar, que permitirá receber eletrões das quinonas, segundo uma via de transferência de eletrões que envolve três hemos, e assim reduzir o peróxido de hidrogénio no periplasma. A YhjA WT e a variante YhjA M125A (mutação no ligando distal axial proposto do hemo NT) foram produzidas de forma homóloga em E. coli C41 (DE3)/pET28a_yhjA WT ou M125A para obter a forma nativa da YhjA, ou E. coli C41 ( DE3)/pET22b_yhjA WT ou M125A para obter a forma solúvel da YhjA. A forma nativa da YhjA foi produzida pela primeira vez, com razões de pureza (A407nm/A280nm) de 0,7 e 1,4 para a YhjA WT e a variante YhjA M125A, respetivamente. A YhjA WT e a variante YhjA M125A foram caracterizadas utilizando espectroscopia de UV-visível, exibindo as bandas de Soret e Q características. Estudos cinéticos preliminares, em condições de estado estacionário utilizando ABTS2- como doador artificial de eletrões, revelaram que tanto a YhjA WT como a variante M125A são cataliticamente ativas. A caracterização espectroscópica da YhjA solúvel demonstrou diferenças entre a YhjA WT e a variante YhjA M125A, nos espetros de UV-visível, sendo que o hemo NT da variante encontra-se num estado high-spin, e provavelmente terá um potencial de redução inferior; por CD demonstrou-se que a variante YhjA M125A é termodinamicamente mais instável que a YhjA WT, com uma menor TM (43 ºC vs 49 ºC). As curvas de Michaelis-Menten foram obtidas para a YhjA WT e a variante M125A, nos estados oxidada e valência-mista, sendo que a YhjA WT tem o maior valor estimado para KM (15,4 ± 0,8 mM), enquanto que o menor KM estimado foi para a YhjA WT no estado de valência mista (9,2 ± 0,4 mM). Estudos de ligação seguidos por titulações UV-visíveis, juntamente com cinética de inibição, utilizando azida e imidazol, revelaram que a YhjA tem uma maior afinidade para o imidazol. Este liga-se num mecanismo que envolve duas etapas, ao contrário da azida. Ambos os compostos apresentam um mecanismo misto de inibição competitiva/não-competitiva. Este trabalho contribui com conhecimento sobre o envolvimento do hemo NT no mecanismo catalítico e forneceu evidências da inibição da YhjA utilizando azida e imidazol, sendo o ponto de partida para a identificação de novos compostos terapêuticos que possam ser usados para inibir esta enzima.
Descrição
Palavras-chave
E. coli inhibition studies kinetic parameters NT haem peroxidase tri-hemic enzyme