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Publicação
Estudo da libertação de ferro em miniferritinas
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Orientador(es)
Resumo(s)
O presente trabalho teve como principais objectivos o estudo do mecanismo da
libertação do ferro em proteínas da família da ferritina (DNA-binding proteins from
starved cells, Dps), bem como a identificação, produção e caracterização de potenciais parceiros redox destas proteínas através da utilização de técnicas bioquímicas e espectroscópicas apropriadas.
Foram identificadas no genoma de Marinobacter hydrocarbonoclasticus duas
flavoproteínas (2375 e 3073) reconhecidas como possíveis parceiros redox da Dps de
Pseudomonas nautica 617.
Todas as proteínas foram expressas heterologamente em células de E. coli BL21 (DE3) e delineados protocolos de purificação em dois passos, por cromatografias de permuta iónica e de exclusão molecular, que permitiram obter rendimentos expressivos (Dps — 31,9 mg/L de cultura, Flavoproteína 2375 — 73 mg/L de cultura e Flavoproteína 3073 — 79,4 mg/L de cultura).
Aquando da purificação da 2375 verificou-se que a estabilidade da holoproteína depende da força iónica, característica que limita a sua utilização como parceiro redox da Dps.
O estudo da reacção de transferência electrónica foi iniciado com testes preliminares através da espectroscopia de UV/Visível, permitindo avaliar da
ocorrência da reacção de redução do core férrico da Dps e concomitante libertação do
produto final ferroso, por análise de uma mistura contendo NADH, flavoproteína 3073
oxidada e Dps core Fe. Este estudo não permite, contudo, estabelecer uma relação de
causa efeito concreta e fiável que nos permita identificar o NADH como doador inicial de eletrões e ferro ferroso como produto final desta reacção. O mecanismo de
libertação foi estudado em maior detalhe através de espectroscopia de Mössbauer
permitindo estabelecer a natureza das diferentes espécies intervenientes na reacção e assim verificar, pela primeira vez, que na presença dos três componentes, acima mencionados, existe redução e libertação de ferro previamente incorporado na Dps, na forma de iões ferrosos, bem como determinar parâmetros cinéticos apropriados.
Descrição
Palavras-chave
Dps Parceiros redox Flavoproteínas Espectroscopia de UV/visível Espectroscopia de Mössbauer Libertação de ferro