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Publicação
Understanding the detailed mechanism of interaction between La-related proteins and their RNA targets
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Autores
Orientador(es)
Resumo(s)
The importance of maturation and processing of all RNA molecules is directly related to RNA-binding proteins (RBPs) and their RNA-binding domains (RBDs). Amongst this class of proteins is the La-related proteins (LaRPs) superfamily, that is characterized by a conserved RNA-binding unit labeled the La-module, which is composed by the La motif (LaM) and the RNA-recognition motif 1 (RRM1). The work presented in this report concerns LaRP4B and its relationship with LaRP4A, since both proteins have identified functions related to cancer and further knowledge about them is crucial in order to find possible treatments. The expression and purification of LaRP4B La-module and RRM1 constructs was successful and allowed to pro-duce 15N RRM for future NMR experiments. While using data from previous experiences, the backbone assignment of the RRM was done with a completion of almost 38% of all residues. This assignment also permitted to identify shifts that belonged to the tag present in the RRM. These findings helped to establish a new purification protocol for the RRM so that the tag can be cleaved by introducing an on-column cleavage step. Finally, by utilizing the chemical shifts of the LaRP4B RRM and La motif, obtained by other group members, a Chemical Shift Index study allowed the comparison between the predicted secondary structure of these domains and the ones from LaRP4A. This comparison showed no major differences between both structures that could indicate why the RNA targets are so different between these two closely related members of the LaRP4 family. Further studies are necessary to unveil the mechanism of inter-action between LaRP4B and RNA.
O processamento e maturação de RNAs está intimamente ligada às proteínas que ligam RNA e aos seus domínios. A superfamília das proteínas relacionadas com o módulo La (LaRPs) faz parte desta classe de proteínas e é normalmente caracterizada por uma unidade ligação a RNAs bastante conservada denominada módulo La, que é formado pelo domínio La (LaM) e pelo domínio de reconhecimento de RNA 1 (RRM1). O trabalho apresentado neste relatório está relacionado com a proteína LaRP4B e a sua relação com a proteína LaRP4A, uma vez que ambas as proteínas foram já identificadas com tendo algum tipo de influência em dife-rentes tipos de cancro e é necessário aprofundar o conhecimento sobre ambas de forma a poder encontrar possíveis terapias. A expressão e purificação dos mutantes da proteína LaRP4B (módulo La e RRM1) foi bem-sucedida e levou à produção de RRM marcado isotopicamente com 15N para ser utilizado em experiências de RMN futuras. Utilizando dados de experiências feitas de forma prévia ao trabalho aqui apresentado, foi possível fazer a atribuição parcial (aproximadamente 38%) dos átomos da cadeia principal do RRM da proteína LaRP4B. Esta atribuição permitiu ainda identificar certos desvios que pertenciam à tag presente no RRM. Assim foi possível desenvolver um novo protocolo de purificação para o RRM introduzindo um passo de clivagem da tag em coluna. Em último lugar, utilizando os desvios previamente obtidos tanto do RRM como do LaM da proteína LaRP4B, um estudo do Chemical Shift Index (CSI) permitiu comparar a estrutura secundária destes módulos com os mesmos, mas da proteína LaRP4A. Esta comparação demonstrou que não existem diferenças significativas entre as duas estruturas que possam indicar o porquê dos RNAs que cada uma liga serem tão diferentes apesar de as duas proteínas serem membros muito próximos da família LaRP4. Mais estudos serão necessários de forma a entender o mecanismo de interação entre a proteína LaRP4B e o seu RNA alvo.
O processamento e maturação de RNAs está intimamente ligada às proteínas que ligam RNA e aos seus domínios. A superfamília das proteínas relacionadas com o módulo La (LaRPs) faz parte desta classe de proteínas e é normalmente caracterizada por uma unidade ligação a RNAs bastante conservada denominada módulo La, que é formado pelo domínio La (LaM) e pelo domínio de reconhecimento de RNA 1 (RRM1). O trabalho apresentado neste relatório está relacionado com a proteína LaRP4B e a sua relação com a proteína LaRP4A, uma vez que ambas as proteínas foram já identificadas com tendo algum tipo de influência em dife-rentes tipos de cancro e é necessário aprofundar o conhecimento sobre ambas de forma a poder encontrar possíveis terapias. A expressão e purificação dos mutantes da proteína LaRP4B (módulo La e RRM1) foi bem-sucedida e levou à produção de RRM marcado isotopicamente com 15N para ser utilizado em experiências de RMN futuras. Utilizando dados de experiências feitas de forma prévia ao trabalho aqui apresentado, foi possível fazer a atribuição parcial (aproximadamente 38%) dos átomos da cadeia principal do RRM da proteína LaRP4B. Esta atribuição permitiu ainda identificar certos desvios que pertenciam à tag presente no RRM. Assim foi possível desenvolver um novo protocolo de purificação para o RRM introduzindo um passo de clivagem da tag em coluna. Em último lugar, utilizando os desvios previamente obtidos tanto do RRM como do LaM da proteína LaRP4B, um estudo do Chemical Shift Index (CSI) permitiu comparar a estrutura secundária destes módulos com os mesmos, mas da proteína LaRP4A. Esta comparação demonstrou que não existem diferenças significativas entre as duas estruturas que possam indicar o porquê dos RNAs que cada uma liga serem tão diferentes apesar de as duas proteínas serem membros muito próximos da família LaRP4. Mais estudos serão necessários de forma a entender o mecanismo de interação entre a proteína LaRP4B e o seu RNA alvo.
Descrição
Palavras-chave
La Related Proteins La-module La motif RNA Recognition Motif LaRP4B RNA Binding Proteins