A carregar...
Publicação
Production and Characterization of stimuli-responsive marine proteins
| Nome: | Descrição: | Tamanho: | Formato: | |
|---|---|---|---|---|
| 3.36 MB | Adobe PDF |
Autores
Orientador(es)
Resumo(s)
Cephalopods, a family of marine invertebrates, have been a source of
inspiration in the scientific community for their ability to modulate coloration and
texture. The production of structural coloration is associated with reflectins, a family of
proteins that exist in skin organs and that act as Bragg reflectors. Since their discovery,
reflectins have been explored for the production of stimuli-responsive bio-based
materials.
This thesis aimed at the recombinant production, purification and
characterization of reflectin proteins. Two reflectins were selected from different
organisms – Reflectin 1 and Reflectin 2. Both proteins were expressed in Escherichia
coli in a rich culture medium and the proteins were then purified by Immobilized Metal
Affinity Chromatography method. The purification of reflectin 2 resulted in a lower
recovery yield (7%) in comparison to reflectin 1(27%). Thus, the purification of reflectin
2 was attempted by Reverse-Phase Chromatography resulting in a higher yield (41%).
Reflectin 1 was purified with a final of 73%, while reflectin 2 was purified by both
chromatographic methods with a final of 95%.
Biophysical properties of the proteins were characterized by several techniques
such as Circular Dichroism to determine the secondary structure and to evaluate the
thermal stability of the proteins; and Dynamic Light Scattering to determine the particle
size and charge in different pH values (1.5, 2.0, 3.0, 8.0 and 11.1). The proteins were
characterized as intrinsically disordered proteins as no predominant secondary
structure was observed. Protein’s self-assembly property is influenced by a progressive
neutralization of the charge. The reversible self-assembly is related to the number of
histidines in the reflectin sequence, reflectin 2 demonstrated the ability to reversible the
self-assembly upon a cyclical pH change.
Overall, the thesis reports for the first time on the production of reflectin 2 and
the comparison of structural characterization between reflectin 1 and reflectin 2.
Os cefalópodes, uma família de invertebrados marinhos, têm vindo a despoletar curiosidade na comunidade científica pela sua capacidade de modulação da coloração e da textura. A produção da coloração estrutural está associada às reflectinas, a família de proteínas que existem nos orgãos da pele que actuam como reflectores Bragg. Desde a sua descoberta, as refletinas têm vindo a ser exploradas para a produção de biomateriais responsivos a estímulos. Um dos objectivos desta dissertação foi a produção recombinante, purificação e a caracterização de duas reflectinas. Neste estudo, as proteínas selecionadas provêm de diferentes organismos: a reflectina 1 e a reflectina 2. Ambas as proteínas foram produzidas em Escherichia coli num meio de cultura rico, posteriormente a purificação foi realizada por um método cromatográfico de afinidade de iões metálicos imobilizados. O rendimento da purificação da reflectina 6 obtido (7%) foi inferior ao valor obtido da reflectina 1 (27%), posto isto a estratégia de purificação desta reflectina foi alterada para um método cromatográfico de fase reversa, onde se obteve um rendimento de purificação superior (41%). O rácio de pureza obtido para a reflectina 1 foi de 73%, enquanto a reflectina 2 obteve-se 95% para os dois métodos cromatográficos. As propriedades biofísicas das proteínas foram caracterizadas por várias técnicas, tais como: o Circular Dichroism que permitiu determinar a estrutura secundária e avaliar a estabilidade térmica das proteínas.; a Dynamic Light Scattering que permitiu determinar o tamanho e a carga das partículas formadas de acordo com variação do pH (1,5; 2,0; 3,0; 8,0 e 11,1). As reflectinas foram caracterizadas como proteínas intrinsecamente desordenadas, uma vez que não há estrutura secundária predominante. A capacidade de self-assembly é influenciada por um aumento progressivo do pH, que permite uma neutralização das cargas e promove a agregação. A capacidade do self assembly ser reversível está associada ao número de histidinas presentes na sequência da reflectina, a reflectina 2 demonstrou a capacidade do self- assembly ser reversível por uma variação cíclica de pH. De um modo geral, a dissertação reporta pela primeira vez a produção da reflectina 2 e uma comparação estrutural entre a reflectina 1 e a reflectina 2.
Os cefalópodes, uma família de invertebrados marinhos, têm vindo a despoletar curiosidade na comunidade científica pela sua capacidade de modulação da coloração e da textura. A produção da coloração estrutural está associada às reflectinas, a família de proteínas que existem nos orgãos da pele que actuam como reflectores Bragg. Desde a sua descoberta, as refletinas têm vindo a ser exploradas para a produção de biomateriais responsivos a estímulos. Um dos objectivos desta dissertação foi a produção recombinante, purificação e a caracterização de duas reflectinas. Neste estudo, as proteínas selecionadas provêm de diferentes organismos: a reflectina 1 e a reflectina 2. Ambas as proteínas foram produzidas em Escherichia coli num meio de cultura rico, posteriormente a purificação foi realizada por um método cromatográfico de afinidade de iões metálicos imobilizados. O rendimento da purificação da reflectina 6 obtido (7%) foi inferior ao valor obtido da reflectina 1 (27%), posto isto a estratégia de purificação desta reflectina foi alterada para um método cromatográfico de fase reversa, onde se obteve um rendimento de purificação superior (41%). O rácio de pureza obtido para a reflectina 1 foi de 73%, enquanto a reflectina 2 obteve-se 95% para os dois métodos cromatográficos. As propriedades biofísicas das proteínas foram caracterizadas por várias técnicas, tais como: o Circular Dichroism que permitiu determinar a estrutura secundária e avaliar a estabilidade térmica das proteínas.; a Dynamic Light Scattering que permitiu determinar o tamanho e a carga das partículas formadas de acordo com variação do pH (1,5; 2,0; 3,0; 8,0 e 11,1). As reflectinas foram caracterizadas como proteínas intrinsecamente desordenadas, uma vez que não há estrutura secundária predominante. A capacidade de self-assembly é influenciada por um aumento progressivo do pH, que permite uma neutralização das cargas e promove a agregação. A capacidade do self assembly ser reversível está associada ao número de histidinas presentes na sequência da reflectina, a reflectina 2 demonstrou a capacidade do self- assembly ser reversível por uma variação cíclica de pH. De um modo geral, a dissertação reporta pela primeira vez a produção da reflectina 2 e uma comparação estrutural entre a reflectina 1 e a reflectina 2.
Descrição
Palavras-chave
Reflectins Self-Assembly Reversible Self-Assembly