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Publicação
Desenvolvimento de um ensaio de hibridação múltipla (MHA-MULTIPLE REGION HYBRIDIZATION ASSAY) para identificação presumível de vírus da imunodeficiência humana do tipo 1 (HIV-1) dos subtipos B, G e de formas recombinantes CRF14_BG e CRF02_AG circulantes em Portugal
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Orientador(es)
Resumo(s)
A maioria dos métodos utilizados na caracterização genética do HIV-1 baseia-se na análise de regiões específicas do genoma viral, fornecendo informação parcial sobre o mesmo e, por consequência, revelando-se inadequados para a identificação de vírus recombinantes. O único método que permite uma caracterização integral do genoma
viral passa pela sua sequenciação completa. No entanto, este é um método dispendioso, laborioso e de difícil implementação quando se pretende a análise de elevados números de amostras. Como alternativa a este último, o conjunto de métodos genericamente
designados de MHA (Multiple Region Hybridization Assay) baseiam-se na amplificação, por PCR em tempo-real, de várias regiões ao longo do genoma viral e na sua caracterização com sondas específicas (TaqMan). Tendo este modelo por base, o objectivo deste estudo foi o desenvolvimento de um ensaio de hibridação múltipla (MHABG0214) passível de ser aplicado ao estudo de um elevado número de amostras.
Este método foi desenvolvido tendo como objectivo a genotipagem as estirpes circulantes dominantes na epidemia Portuguesa, nomeadamente os subtipos B, G e formas genéticas recombinantes CRF02_AG e CRF14_BG.
Com base em alinhamentos de sequências de referência de genoma completo, delinearam-se primers universais e subtipo-específicos para a amplificação de diversas regiões codificantes distribuídas ao longo do genoma do HIV-1 (Gag, Protease, Transcriptase Reversa, Integrase, Rev, Gp120 e Gp41). A optimização foi efectuada, inicialmente, para um conjunto de amostras de referência e seguidamente avaliada num
conjunto de 50 amostras clínicas. O MHABG0214 foi implementado numa estratégia de PCR em tempo-real, numa detecção dependente de SYBR® Green I para todas as regiões ou, como alternativa, usando sondas TaqMan (Gp41). Apresentamos ainda uma estratégia em que a análise de resultados se baseia, simplesmente, numa abordagem
usando PCR/gel de agarose convencional. Estas abordagens constituem ferramentas úteis na identificação das estirpes de HIV-1 em Portugal.
Since most methods used for the genetic characterization of HIV-1 are based on the analysis of singular regions of the viral genome, they only provide a fragmented view of the later, and often fail to identify recombinant viruses. The most efficient method for HIV-1 genetic characterization involves full-genome sequencing, but the associated costs and low throughput preclude it from being routinely used for the analysis of large numbers of viral strains. One of the alternatives for a consistent genetic analysis of large numbers of viral strains are the methods generally known as Multi Region Hybridization Assays (MHA). MHA relies on the amplification by real-time PCR of several regions scattered along the HIV-1 genome, and their characterization subtype-specific TaqMan probes. In this context, the aim of our study was the development of a new multi-region hybridization assay (MHABG0214) for genotyping of the major HIV-1 forms circulating in Portugal, subtypes B, G and CRF02_AG and CRF14_BG circulating recombinant viruses. Based on full alignments of representative HIV-1 reference sequences, we designed universal and subtype-specific primers/probes for the amplification of several different coding regions of the viral genome (Gag, Protease, Reverse Transcriptase, Integrase, Rev, Gp120 and Gp41). Optimization of reaction conditions, established using 7 HIV-1 references, served as a starting point for the analysis of 45 HIV-1 strains circulating in Portugal. MHABG0214 was implemented using a real-time PCR-based approach, with detection dependent on the use of either SYBR® Green I (all regions) or a TaqMan probe (Gp41). Alternatively, a technically less demanding strategy based on conventional PCR and agarose gel analysis of reaction products was also developed. Regardless of the strategies used and the results obtained, these approaches are useful tools to identify strains of HIV-1 in Portugal.
Since most methods used for the genetic characterization of HIV-1 are based on the analysis of singular regions of the viral genome, they only provide a fragmented view of the later, and often fail to identify recombinant viruses. The most efficient method for HIV-1 genetic characterization involves full-genome sequencing, but the associated costs and low throughput preclude it from being routinely used for the analysis of large numbers of viral strains. One of the alternatives for a consistent genetic analysis of large numbers of viral strains are the methods generally known as Multi Region Hybridization Assays (MHA). MHA relies on the amplification by real-time PCR of several regions scattered along the HIV-1 genome, and their characterization subtype-specific TaqMan probes. In this context, the aim of our study was the development of a new multi-region hybridization assay (MHABG0214) for genotyping of the major HIV-1 forms circulating in Portugal, subtypes B, G and CRF02_AG and CRF14_BG circulating recombinant viruses. Based on full alignments of representative HIV-1 reference sequences, we designed universal and subtype-specific primers/probes for the amplification of several different coding regions of the viral genome (Gag, Protease, Reverse Transcriptase, Integrase, Rev, Gp120 and Gp41). Optimization of reaction conditions, established using 7 HIV-1 references, served as a starting point for the analysis of 45 HIV-1 strains circulating in Portugal. MHABG0214 was implemented using a real-time PCR-based approach, with detection dependent on the use of either SYBR® Green I (all regions) or a TaqMan probe (Gp41). Alternatively, a technically less demanding strategy based on conventional PCR and agarose gel analysis of reaction products was also developed. Regardless of the strategies used and the results obtained, these approaches are useful tools to identify strains of HIV-1 in Portugal.
Descrição
Palavras-chave
Biologia molecular Microbiologia Médica Virologia Diagnóstico Hibridação HIV1
Contexto Educativo
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Editora
IHMT
Instituto de Higiene e Medicina Tropical
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