IHMT: MM - Dissertações de Mestrado
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- Estudo do efluxo na resistência a tetraciclinas em Staphylococcus pseudintermediusPublication . SANTOS, Ana Filipa Carvalho Pinto dos; COUTO, Isabel; COSTA, Sofia SantosA bactéria Staphylococcus pseudintermedius, agente comensal da pele e tecidos moles dos animais de companhia, é também um agente patogénico oportunista, responsável pela maioria das infeções da pele e tecidos moles (SSTIs) nestes animais, em particular no cão, e que apresenta frequentemente resistência aos principais antibióticos utilizados na terapêutica. Este trabalho teve como ponto de partida um estudo anterior com 155 isolados de S. pseudintermedius associados a SSTIs em animais de companhia na região de Lisboa. Para o presente estudo, foram selecionadas as 28 estirpes dessa coleção que apresentaram resistência às tetraciclinas (o segundo fenótipo de resistência mais frequente), associado à presença dos genes tet(K) e tet(L), que codificam para bombas de efluxo. Neste estudo pretendeu-se avaliar a contribuição do efluxo para a resistência às tetraciclinas em S. pseudintermedius através de várias abordagens, analisando em particular a relação entre o fenótipo de suscetibilidade à tetraciclina, doxiciclina e minociclina com presença dos determinantes tet, perfil plasmídico e a atividade de efluxo de tetraciclinas. Das 28 estirpes estudadas, vinte e uma (21/28, 75,0%) possuem um plasmídeo. Os plasmídeos detetados foram agrupados em quatro perfis plasmídicos, de acordo com o seu tamanho e perfil de restrição. A larga maioria das estirpes apresenta plasmídeos pequenos (< 5 kb) e apenas duas estirpes apresentaram plasmídeos de tamanho intermédio (≈ 15kb, 2/21, 9,5%). O gene tet(K) foi detetado nos quatro perfis plasmídicos das 21 estirpes, 16 das quais pertencem à linhagem clonal ST71, prevalente na coleção em estudo e a mais disseminada na Europa. O gene tet(L) foi identificado em apenas uma estirpe da linhagem clonal ST25, para a qual não foi detetado nenhum plasmídeo. A transferência por eletrotransformação do plasmídeo pV143, de ≈ 4 kb e representativo do perfil P1, para Staphylococcus aureus, permitiu confirmar a presença do gene tet(K) neste plasmídeo e a sua associação à resistência à tetraciclina e doxiciclina. A caracterização mais detalhada do transformante, S. aureus RN4220:pV143, permitiu identificar atividade de efluxo por ensaios de suscetibilidade às tetraciclinas com diferentes inibidores de efluxo, incluindo o verapamil. Este mesmo transformante foi utilizado para otimizar um novo protocolo experimental de avaliação do efluxo de tetraciclinas em estafilococos, baseado numa análise fluorométrica. Testaram-se diferentes condições experimentais, nomeadamente substratos de efluxo, temperatura do ensaio, pH e presença de ião Mg2+ no meio. Os resultados obtidos confirmaram atividade de efluxo de tetraciclina no transformante, associada ao determinante da bomba Tet(K). A presença do gene tet(M), determinante cromossómico de proteção ribossómica, foi também associada à resistência à tetraciclina e doxiciclina, e nalgumas estirpes também à minociclina. Este estudo demonstra assim, que diferentes mecanismos contribuem para a resistência às tetraciclinas em S. pseudintermedius, entre os quais o efluxo, este associado à presença do gene tet(K), maioritariamente plasmídico, podendo comprometer a terapêutica de SSTIs, uma das causas mais frequentes de prescrição de antibióticos em Medicina Veterinária.
- Evaluation of the effect of protease inhibitors on in vitro culture of Babesia ovisPublication . MALAQUIAS, Jéssica Sofia Vieira; ANTUNES, Sandra Isabel da Conceição; DOMINGOS, Ana Isabel Amaro GonçalvesA babesiose é uma doença causada por protozoários do género Babesia com impactos consideráveis a nível de saúde animal e também económico em diversos países. Este parasita é transmitido por carraças, engloba um elevado número de espécies e afeta diversos vertebrados. Em particular Babesia ovis, transmitida maioritariamente pela espécie Rhipicephalus bursa, é causadora da babesiose ovina, reconhecendo-se a sua alta taxa de mortalidade em animais infetados, causando prejuízos para muitos produtores. Atualmente as medidas de controlo disponíveis baseiam-se na utilização de fármacos e vacinas atenuadas direcionadas ao parasita e acaricidas direcionadas aos vetores. Os fármacos mais utilizados são o dipropionato de imidocarb e o aceturato de diminazeno. No entanto a toxicidade, contaminações no leite e carne e ainda inibição do parasita incompleta, tornam essencial a procura de novos fármacos, que permitam eliminação do parasita de forma segura para os animais. Durante muitos anos, a microscopia foi amplamente utilizada para o screening de compostos e fármacos contra Babesia. No entanto, com os avanços tecnológicos e o desenvolvimento de métodos moleculares, surgiram novas técnicas que revolucionaram esta área. Métodos como a PCR quantitativa (qPCR) e os ensaios de alta eficiência (high-throughput screening) permitiram implementar abordagens mais rápidas e eficazes, possibilitando o teste simultâneo de inúmeros fármacos. Os métodos baseados em fluorescência são soluções que permitem a testagem de compostos em pouco tempo e de forma sensível. Nesta abordagem o sinal de fluorescência pode ser analisado recorrendo a técnicas diferentes como a citometria de fluxo ou o uso de um fluorímetro. Enquanto a primeira analisa as células individualmente, permitindo detalhar sobre a distribuição da fluorescência em diferentes subpopulações celulares, a segunda fornece um valor de fluorescência total ou médio da amostra, ideal para comparações entre amostras diferentes. De facto, esta última técnica está otimizada para outros Apicomplexa mostrando-se indicada para o screening em larga escala de potenciais agentes terapêuticos. Assim, o presente trabalho tem como objetivos primários a otimização de um protocolo de fluorescência e ainda a avaliação da inibição de crescimento de B. ovis por um painel de compostos, os quais se especula que inibam protéases cisteínicas. Para alcançar os objetivos propostos a linearidade entre parasitémia e unidades de fluorescência relativos foi determinada, bem como as condições ideais para a realização de ensaios relativamente à sua duração, troca diária de meio de cultura e hematócrito. O efeito inibitório da atovaquona, imidocarb, tulatromicina e blasticidina-S foram avaliados de forma a selecionar um controlo robusto. Os resultados mostram que as melhores condições para o ensaio são a realização do mesmo ao longo de 96 horas, com troca diária de meio e utilizando um hematócrito de 10%. A atovaquona e blasticidina-S foram capazes de inibir totalmente o crescimento de B. ovis. Dos 24 compostos testados a 5 μM, dois compostos demonstram uma percentagem de inibição superior a 80%. Este trabalho reporta, pela primeira vez a otimização de um protocolo baseado em fluorescência para a testagem de compostos anti-B. ovis.
- Seroprevalência da Infeção por Leishmania em Dadores de Sangue da Área Metropolitana de LisboaPublication . ANDRADE, Patrícia Calixto Pires; MAIA, Carla; CONCEIÇÃO, CláudiaAs leishmanioses são um grupo de doenças parasitárias causadas por protozoários do género Leishmania, que são transmitidas através da picada de insetos vetores pertencentes ao género Phlebotomus no Velho Mundo e Lutzomyia no Novo Mundo. O cão é o principal hospedeiro e reservatório doméstico da leishmaniose visceral humana na Bacia mediterrânica e na América do Sul, onde a leishmaniose é endémica, sendo L. infantum o agente etiológico responsável. A infeção assintomática é a forma de expressão predominante da exposição aos parasitas. Estudos sobre a prevalência da infeção assintomática nestas regiões fundamentaram-se em testes serológicos em dadores de sangue. Foram feitos estudos regionais em Espanha que revelaram uma seroprevalência em dadores de sangue que variou entre 1 e 8%. Já em Portugal foram realizados dois estudos localizados em populações distintas onde a seroprevalência variou entre 0 e 2%. O presente estudo teve como principais objetivos estimar a seroprevalência de infeção por Leishmania sp. em dadores de sangue da Área Metropolitana de Lisboa e caracterizar os dadores em termos sociodemográficos, conhecimentos, perceções e práticas relacionadas com a leishmaniose. Este projeto teve como população-alvo individuos que efetuaram uma dádiva de sangue na área metropolitana de Lisboa. Os 1006 participantes, com idades entre 18 e 65 anos, preencheram um questionário para a recolha de dados sociodemográficos e de informação sobre conhecimentos, perceções e praticas (CPP) sobre leishmaniose. Para detetar a presença de anticorpos anti-Leishmania no soro foi utilizado um kit comercial ELISA. O estudo decorreu entre fevereiro e junho de 2022. Em 1005 amostras de soro analisadas, 47 foram positivas. A proporção de positivos foi de 4,7%, alinhando-se de forma consistente com os dados obtidos nos estudos regionais realizados com dadores de sangue em Espanha. No total, 72,2% dos participantes já tinha ouvido falar da doença. O grupo etário onde houve maior positividade foi dos 46 aos 50 anos (31,9%) e 66,0% dos casos positivos correspondiam a individuos do sexo masculino. Para individuos assintomáticos, a possibilidade de transmissão do parasita através de transfusões de sangue é preocupante, embora em Portugal haja formas de reduzir ou até mesmo anular esse risco através método de leucodepleção. É importante a monitorização e vigilância na identificação de anticorpos anti-Leishmania em individuos assintomáticos.
- A new antiviral strategy for pandemic and seasonal influenzaPublication . MATINHOS, Renata Pereira das Neves Baptista; TOMÁS, Ana; REICHEL, Anna; SANTOS, Nuno C.Resumo O vírus da gripe continua a representar um importante problema de saúde pública a nível mundial. De acordo com a Organização Mundial de Saúde (WHO), acredita-se que este vírus seja responsável por mil milhões de casos e até 650 000 mortes por ano. A sua capacidade de evoluir rapidamente, associada ao aparecimento de estirpes resistentes aos antivirais, denota o risco de (re)aparecimento de vírus pandémicos e sublinha a necessidade urgente de novas opções antivirais. Recentemente, surgiu o interesse em torno de pequenas moléculas capazes de facilitar o transporte de aniões através de bicamadas lipídicas - anionóforos - e o seu potencial anticancerígeno, antiparasitário e antimicrobiano já foi descrito. No entanto, não existia evidência da sua atividade antiviral. O trabalho desenvolvido e apresentado nesta dissertação focou-se na investigação do potencial antiviral de uma nova biblioteca destas pequenas moléculas contra o vírus da gripe A (IAV) subtipo H1N1. Foram estudados cinco anionóforos com o objetivo de selecionar o(s) candidato(s) mais promissor(es) para futura caraterização detalhada, otimização, formulação e validação clínica. A citotoxicidade causada por estas moléculas foi avaliada numa linha celular suscetível animal (MDCK CCL-34™) e em células epiteliais pulmonares humanas (Calu-3 HTB-55™), por citometria de fluxo. Subsequentemente, a atividade antiviral, baseada em duas abordagens diferentes de administração dos compostos - profilática e terapêutica - foi avaliada por ensaios em placa. Estes resultados foram ainda confirmados pela reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa quantitativa (RT-qPCR) através da amplificação do gene da matriz (M). Para complementar os testes citotóxicos efetuados, foram realizados ensaios de hemólise para avaliar a capacidade do candidato mais promissor para causar hemólise de glóbulos vermelhos humanos (hRBCs). Este estudo revelou que uma destas novas moléculas tem propriedades antivirais contra o IAV, com a abordagem terapêutica a apresentar os melhores resultados: o composto AS-46 provocou uma redução estatisticamente significativa do título viral e uma percentagem de redução da atividade viral de 79.7% ± 11.2%. Foi igualmente observada uma redução estatisticamente significativa (p = 0.0096) do número de cópias do gene M obtidas por RT-qPCR, corroborando os resultados obtidos pelos ensaios em placa. Além disso, na concentração testada, o AS-46 não causou hemólise dos hRBCs nem apresentou efeitos citotóxicos em nenhuma das linhas celulares testadas. No geral, este trabalho indica que o composto anionóforo AS-46 pode inibir eficazmente o IAV in vitro. A nossa hipótese é que a sua ação está relacionada com a desacidificação dos endossomas da célula hospedeira, o que impede a fusão do envelope viral com a membrana endossomal, durante os passos de internalização do ciclo de replicação. Esta nova estratégia antiviral poderá contribuir para a preparação de uma resposta global e eficiente em futuros surtos pandémicos.
- Aplicação da tecnologia de sequenciação da nova geração (NGS), para o estudo da resistência aos antirretrovirais na infeção por vírus da imunodeficiência humana tipo 2Publication . GONÇALVES, Maria de Fátima Martins; GOMES, PerpétuaO vírus da imunodeficiência humana tipo 2, um dos agentes etiológicos da SIDA, foi identificado em 1985. Trata-se de uma infeção zoonótica, com origem nos símios sooty mangabeys. Quando comparada com a infeção pelo vírus da imunodeficiência humana tipo 1, esta infeção possui menor taxa de infecciosidade, menor virulência, transmite-se mal sexualmente assim como verticalmente e consequentemente apresenta menor diversidade genética. Caracteriza-se ainda por ter um período assintomático, na maior parte dos casos, igual ou superior a 20 anos. No entanto, se não for tratada pode evoluir para SIDA e morte. A epidemia por HIV-2 é endémica nalguns países da África Ocidental e encontra-se também fora do continente africano, em países que possuem ligações a essas regiões. Portugal, pelas suas relações de colonização com alguns desses países, apresenta o maior número de pessoas com HIV 2, na Europa. As orientações da DGS, INSA e APECS recomendam a monitorização destes indivíduos após o diagnóstico, e sempre que haja carga viral detetável, a realização de testes de resistência aos antirretrovirais para o HIV-2, para facilitar a escolha do melhor regime terapêutico para cada caso. Devido à ausência de testes comerciais, tornou-se imperativo investir, investigar e desenvolver metodologias in house, por forma a contribuir para a melhoria da qualidade de vida destes indivíduos. O principal objetivo do estudo aqui apresentado foi desenvolver uma metodologia, por sequenciação de nova geração (NGS-Ion Torrent), capaz de identificar mutações nas regiões de interesse do gene pol (protéase, transcriptase reversa e integrase), principais alvos terapêuticos para os antirretrovirais, atualmente disponíveis. O segundo objetivo foi comparar os resultados obtidos por NGS, com a metodologia utilizada até à data (método Sanger), e por último integrar a nova metodologia na prática clínica. Utilizaram-se primers desenhados para as três regiões do gene pol, e recorreu-se à plataforma Sentosa® para a extração de ácidos nucleicos e criação de bibliotecas. O passo seguinte foi a realização de PCR por emulsão. Por fim a sequenciação foi realizada por Ion Torrent. Os ficheiros BAM obtidos após a sequenciação foram tratados e editados para conversão num ficheiro fasta, que permitisse utilizar um algoritmo de interpretação para identificação de mutações associadas a resistência aos antirretrovirais. Neste trabalho, por NGS, foi possível sequenciar com sucesso 92% das amostras para a região da protéase e 91% para a região da transcriptase reversa. Na região da integrase o sucesso foi menor (49%), indicando que será necessário continuar a otimizar esta região. No estudo comparativo entre os dois métodos, obteve-se uma concordância de p<0,001 estatisticamente significativa para as três regiões, embora por NGS se tenham detetado mais mutações Apesar da necessidade de continuar a otimizar a região da integrase, a realização do teste de resistência aos antirretrovirais para o HIV-2, pela metodologia NGS-Ion Torrent mostrou dar resposta adequada e consequentemente encontra-se em condições de ser utilizada na prática clínica.
- Desenvolvimento e otimização de um modelo de infeção em Galleria mellonella para ensaios de patogenicidadePublication . RODRIGUES, Telma de Afonseca; COSTA, Sofia Santos; MARQUES, Joana; SILVEIRA, HenriqueRESUMO A larva de Galleria mellonella representa um novo modelo de infeção invertebrado com potencial aplicação em diversas áreas de investigação. Até à data, G. mellonella tem sido usada em estudos de avaliação do potencial de virulência de agentes patogénicos, de interação hospedeiro-agente patogénico e ensaios de farmacotoxicidade. A sua aplicabilidade tem sido demonstrada para alguns dos agentes patogénicos de maior relevância clínica, incluindo Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus aureus. Os objetivos principais deste trabalho foram a implementação de uma colónia de G. mellonella no GHTM/IHMT-NOVA, e a otimização de protocolos de infeção para ensaios de patogenicidade para quatro agentes patogénicos bacterianos relevantes: P. aeruginosa, S. aureus, Neisseria gonorrhoeae e Escherichia coli. Adquiriram-se larvas de G. mellonella na última fase larval a uma casa comercial especializada em animais exóticos e a espécie foi confirmada por sequenciação do gene COI. As larvas foram criadas numa sala dedicada no Insectário do IHMT-NOVA, na ausência de luz, a 27-28ºC e a 60-80% de humidade relativa, com uma dieta rica em nutrientes baseada em farinha de milho, levedura de cerveja, farinha de soja, leite em pó, mel, glicerol e cera de abelha. O ciclo de vida de G. mellonella foi acompanhado e a taxa de oviposição foi determinada. Após otimização de condições de pré-incubação (aclimatização a 37 ºC na ausência de comida), foram conduzidos ensaios de infeção com a estirpe de referência S. aureus ATCC25923 de forma a comparar a suscetibilidade à infeção entre as larvas comerciais e as larvas criadas in-house. O modelo de infeção de G. mellonella foi usado com as larvas in-house para determinar o potencial de virulência das estirpes de referência P. aeruginosa ATCC27583, N. gonorrhoeae ATCC49226, E. coli ATCC25922 e estirpes clínicas de S. aureus. Foi estabelecida no GHTM/IHMT-NOVA uma colónia de G. mellonella. A G. mellonella criada in-house apresentou um ciclo de vida entre 31 a 34 dias. Em média, cada fêmea colocou 1794 ovos, com uma taxa de eclosão de ~34%. Em comparação com as larvas comerciais, as larvas criadas in-house, mostraram ser mais saudáveis e menos suscetíveis à infeção por S. aureus ATCC25923. A pré-incubação das larvas por 48 horas a 37ºC, sendo deprivadas de comida nas últimas 24 horas, mostrou ser a melhor condição de aclimatização. A realização de ensaios de infeção dos quatro agentes patogénicos permitiu, a inóculos equivalentes, diferenciá-los de acordo com o seu potencial de virulência da seguinte forma: P. aeruginosa >> S. aureus > E. coli > N. gonorrhoeae. Este trabalho representa a expansão dos modelos de infeção animal disponíveis no GHTM/IHMT-NOVA e a sua aplicabilidade para estudar agentes patogénicos bacterianos relevantes que são o foco de linhas de investigação em curso no IHMT-NOVA. Trabalho futuro poderá incidir na utilização deste modelo para o estudo de agentes fúngicos e parasitas, assim como estudos de farmacotoxicidade. Palavras-chave: Galleria mellonella; modelo de infeção invertebrado
- Otimização e aplicação de um teste de imunofluorescência indireta para o diagnóstico de leptospirose em laboratórios convencionaisPublication . FERNANDES, Wilmer Augusto; ARMADA, Ana Maria; VIEIRA, Maria LuísaRESUMO A leptospirose é uma zoonose re-emergente com distribuição mundial, com mais de 1.000.000 de casos graves notificados anualmente na população humana. É causada por espiroquetas patogénicas do género Leptospira. O diagnóstico definitivo da leptospirose, juntamente com achados clínicos e epidemiológicos compatíveis, baseia-se no Teste de Aglutinação Microscópica (TAM), um teste sorológico de referência recomendado pela Organização Mundial da Saúde (OMS) o qual, no entanto, está apenas disponível nos laboratórios de referência em alguns países nos diversos continentes, com base em cerca de três dezenas de serovares de Leptospira interrogans sensu lato. (s.l.). Assim, este estudo visa otimizar um teste de imunofluorescência indireta (Lept-IFA) alternativo à TAM que possa ser útil para o diagnóstico da referida doença, utilizando apenas três sorovares patogénicos, reconhecidos em Portugal, pela alta e ubíqua prevalência. Utilizaram-se os serovares: Copenhageni, Arborea e Pomona representativos de L interrogans s.l. e o serovar Patoc de L. biflexa s.l. (espécie saprófita) os quais foram mantidos em meio de cultura Ellinghaussen, McCullough, Jonhson e Harris (EMJH), até à sua utilização. A fim de preservar as proteínas leptospíricas de superfície da membrana externa as espiroquetas foram centrifugadas a baixa velocidade e o lisado obtido colocado nos diversos poços da lâmina do teste IFA, previamente revestida com lisina e depois fixada com formalina. Foi testado por Lept-IFA um total (N=50) de amostras de soro humano, selecionadas do laboratório de leptospirose/BioBanco do IHMT NOVA, com indicação clínica de possível leptospirose e previamente analisadas por TAM, utilizaramse também como controlo negativo, soros representativos de população saudável e soros testados para dois outros espiroquetas (Borrelia burgdorferi s.l. e Treponema sp), agentes etiológicos da borreliose de Lyme e sífilis, respetivamente. O teste Lept-IFA confirmou todas as amostras positivas testadas por TAM (19+; 38%), (6; 12%) das amostras mostraram resultado não conclusivo (NC), tendo o resultado sido negativo nas restantes amostras (25; 50%). No grupo de soros com resultado não conclusivo, os soros (controlo) de borreliose de Lyme verificou-se uma reação cruzada com o serovar Patoc. Este estudo mostrou que o Lept-IFA pode ser uma ferramenta útil como teste de triagem de primeira linha para o diagnóstico sorológico da leptospirose em regiões/países cujos laboratórios não dispõem do teste de referência recomendado pela OMS. No entanto, o teste Lept-IFA carece de padronização confiável e depende muito da qualificação do observador.
- Estudo da atividade antimalárica de endoperóxidosPublication . CÂNDIDO, Ana Luisa Sousa Micolo; NOGUEIRA, Fátima; DUARTE, DeniseResumo A malária, umas das principais doenças infeciosas globais, e causada por parasitas do género Plasmodium spp. é transmitida por mosquitos fêmea do género Anopheles spp. A resistência de Plasmodium falciparum aos tratamentos antimaláricos tem impulsionado a busca por novas soluções terapêuticas. O presente trabalho focou-se na avaliação da atividade antimalárica de novos endoperóxidos sintéticos contra estirpes resistentes e sensíveis de P. falciparum. Utilizando técnicas in vitro (citometria de fluxo), os compostos foram testados quanto à sua capacidade de inibir a proliferação dos parasitas, com a determinação dos valores de IC50 servindo como medida de atividade. O estudo abrangeu também a análise da atividade estádio-específica dos compostos, verificando a sua eficácia em diferentes fases do ciclo do parasita. Todos os 7 compostos testados, apresentaram atividade sub-micromolar (IC50 < 1μM) contra ambas as estirpes 3D7HT-GFP (sensível) e IPC5202 (resistente). Destes, 6 exibiram IC50 <100 nM, variando entre 2,19 - 31,95 nM na estirpe sensível e 2,44 - 58,08 nM na resistente. Um dos compostos, o trioxolano AS04, foi encapsulado numa partícula formada por cucurbitilos, o conjunto AS04+partícula foi designado AG521. A diferença de atividade entre AS04 e AG521 foi pouco apreciável sendo que o IC50 se manteve abaixo dos 100 nM, e no range de atividades in vitro demonstrada por outros endoperóxidos em uso clínico como a DHA, o arteméter ou o artesunato. Os resultados indicam que os endoperóxidos testados mantêm atividade substancial contra as estirpes de P. falciparum, suscetíveis e resistentes a derivados da artemisinina, sugerindo que estes compostos possuem promissor potencial como antimaláricos.
- Avaliação da atividade in vitro da amlodipina e outros bloqueadores de canais iónicos em Neisseria gonorrhoeaePublication . FERNANDES, João Luís Airosa; RODRIGUES, Liliana; COSTA, SofiaResumo A crescente resistência antimicrobiana representa um desafio global no tratamento de infeções bacterianas, incluindo a gonorreia causada pelo agente etiológico Neisseria gonorrhoeae. Diante deste cenário, o desenvolvimento de novos agentes terapêuticos ou o reposicionamento de fármacos existentes emerge como uma necessidade urgente para o tratamento destas infeções. Este trabalho tem como objetivo estudar o potencial antimicrobiano dos fármacos amlodipina, tioridazina e verapamil, candidatos a reposicionamento contra N. gonorrhoeae, de forma a elucidar a sua possível para aplicação em novas estratégias terapêuticas contra a gonorreia. Determinou-se a Concentração Mínima Inibitória (CMI) dos fármacos contra a estirpe N. gonorrhoeae ATCC 49226, através do método de microdiluição. Seguidamente, analisou-se a cinética de time-kill dos fármacos através da determinação de curvas de viabilidade em intervalos de tempo específicos após a exposição aos fármacos. Posteriormente, avaliou-se o efeito pós-antibiótico (PAE) dos fármacos na estirpe em estudo, através da exposição das bactérias aos fármacos por 1 h, seguindo-se determinação de Unidades Formadoras de Colónias (UFC) após remoção do composto. Por fim, determinou-se a frequência de mutação espontânea da estirpe na presença dos fármacos em estudo, em meio de agar chocolate, durante 24 h. A tioridazina demonstrou o valor de CMI mais baixo, com 16 mg/L, seguida da amlodipina e verapamil com 64 mg/L e 512 mg/L, respetivamente. No ensaio de cinética de time-kill, observou-se a inibição do crescimento bacteriano na presença das concentrações de 5´ e 10´ o valor de CMI dos fármacos candidatos. Neste ensaio, as curvas de viabilidade demonstraram a ação bactericida dos fármacos, durante um período de 24 h. Os fármacos candidatos também demonstraram um PAE superior a 24 h, nas mesmas concentrações testadas. O ensaio da frequência de mutação espontânea demonstrou que, na presença dos fármacos na concentração de 5´ e 10´ o valor de CMI, obteve-se uma baixa frequência de mutações em N. gonorrhoeae, sugerindo uma menor probabilidade de emergência de resistência bacteriana A amlodipina, a tioridazina e o verapamil demonstraram resultados promissores como potenciais fármacos candidatos a reposicionamento para o tratamento de infeções por N. gonorrhoeae. Espera-se que este trabalho contribua para o futuro desenvolvimento de estratégias terapêuticas alternativas que incluam estes fármacos para combater a resistência antimicrobiana em N. gonorrhoeae.
- Apresentação tardia ao diagnóstico de VIH: uma análise da definição de late presentersPublication . ALEMÃO, André Alexandre Correia; MIRANDA, Mafalda; ABECASIS, AnaResumo O diagnóstico tardio do VIH pode estar associado a um maior risco de transmissão do vírus e consequentemente levar a custos mais elevados de cuidados de saúde. Os programas de testagem do VIH são muito importantes para aumentar o diagnóstico precoce. Em 2010, o Grupo de Trabalho Europeu de Consenso sobre late preseneters, definiu os apresentadores tardios como indivíduos com uma contagem de células CD4 inferior a 350 células/μL no momento do diagnóstico, ou um evento definidor de SIDA no momento do diagnóstico, independentemente da contagem de células CD4. Devido à abrupta queda inicial da contagem de CD4 que ocorre na fase aguda da infeção pelo VIH-1, a definição de apresentação tardia levou por vezes a uma classificação errada de indivíduos na fase aguda como apresentadores tardios. Em 2022, um segundo grupo de trabalho sugeriu uma atualização na definição de apresentação tardia, considerando outros critérios. Nesta definição, os non-late presenters são definidos como indivíduos que apresentam evidência laboratorial de infeção recente, último teste de VIH negativo nos últimos 12 meses ou evidência clínica de infeção aguda. Quando os indivíduos apresentam CD4 abaixo de 350 células/μL, temos de avaliar estes três parâmetros com o intuito de excluir um individuo classificado erradamente como late presenter. Os indivíduos diagnosticados durante o período de seroconversão não devem ser considerados como apresentadores tardios. No entanto, esta definição baseia-se em informações clínicas que podem não estar disponíveis em muitos casos. Assim, este estudo tem o objetivo de analisar a definição de late presenters através da utilização de outras metodologias para além da definição existente considerando os valores de células CD4 e o último teste de VIH negativo, com o intuito de evitar este viés de classificação.