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Publicação
Comparative analysis of size-exclusion chromatography and ultracentrifugation for efficient isolation of extracellular vesicles in Multiple Myeloma
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Autores
Orientador(es)
Resumo(s)
Abstract
Small extracellular vesicles (EVs) are key components of intercellular communication
in multiple physiological and pathological processes. In biomedical research, EVs are gaining
significant attention as disease biomarkers and therapeutic targets, particularly in cancer
development and metastasis.
Given the small size of EVs of interest (30 to 150 nm) and the high risk of contamination
with non-small EVs, reliable isolation techniques are required. Ultracentrifugation (UC) is the
gold standard for EV isolation despite being time-consuming and exhibiting poor
reproducibility. Recent methods, such as size-exclusion chromatography (SEC), offer
promising results, but comparative studies are necessary.
In this study, we compared the yield, small EV specificity, and reproducibility of EV
isolation between SEC, combined with ultrafiltration, and sucrose cushion
ultracentrifugation (sUC). EVs were isolated from conditioned culture medium (CCM) using
three myeloma cell lines: MM.1S, ANBL-6, and ALMC-1. The concentration and size of particles
were assessed by nanoparticle tracking analysis, the protein concentration was determined
by bicinchoninic acid assay, and the presence of specific EV markers and non-specific
contaminants was evaluated by western blot.
Our findings indicate that SEC outperforms sUC in yield, recovering more than 8 times
more EVs per volume of CCM used. We also observed that the variability using sUC was 3
times higher than SEC, highlighting better reproducibility when using SEC. The western blot
analysis of non-small EV contaminants revealed that HSP90B1 can be detected in some sUC
samples, whereas it was consistently absent from SEC samples. In summary, SEC emerges
as a more practical, efficient, and consistent method for EV isolation than sUC.
In terms of EV characterization, our work unveiled disparities in vesicle size and
biomarker expression among the different cell lines, underscoring the importance of cell line
selection when studying EVs in multiple myeloma. Our study of different SEC fractions also
revealed distinct particle and protein concentrations, sizes, and expression of markers within
each fraction. This highlights the influence of the fraction window’s choice in downstream
research outcomes. Additionally, our results established HBS with 0.005% of Tween 20 as an
optimized buffer for isolating and preserving EVs at -80°C.
Standardization of small EV isolation methods is lacking, and comparative
assessments are essential to ensure efficient and reproducible EV recovery, regardless of
following applications. Our study shows that SEC outperforms sUC in terms of EV isolation
quality, offering a quicker and potentially more reliable method.
Resumo As vesículas extracelulares (VEs) são componentes-chave da comunicação intercelular em múltiplos processos fisiológicos e patológicos. Na investigação biomédica, as VEs estão a ganhar uma atenção significativa como biomarcadores de doenças e alvos terapêuticos, particularmente no desenvolvimento de cancro e de metástases. Dado o pequeno tamanho das VEs de interesse (30 a 150 nm) e o elevado risco de contaminação com VEs maiores, são necessárias técnicas de isolamento fiáveis. A ultracentrifugação (UC) é a técnica mais usada para o isolamento das vesículas, apesar de ser demorada e apresentar uma baixa reprodutibilidade. Métodos recentes como a cromatografia de exclusão de tamanho (SEC), oferecem resultados promissores, mas são necessários estudos comparativos. Neste estudo, comparámos o rendimento, a pureza e a reprodutibilidade do isolamento de VEs entre SEC, combinada com ultrafiltração, e ultracentrifugação com uma camada de sucrose (sUC). As VEs foram isoladas a partir de meio de cultura condicionado (CCM) utilizando três linhas celulares de mieloma múltiplo: MM.1S, ANBL-6 e ALMC-1. A concentração e o tamanho das partículas foram avaliados por ‘nanoparticle tracking analysis’ nanopartículas (NTA), a concentração de proteínas foi determinada por ‘bicinchoninic acid assay’ (BCA) e a presença de marcadores específicos de VEs e contaminantes não específicos foi avaliada por ‘western blot’. Os nossos resultados indicam que a SEC supera a sUC em termos de rendimento, recuperando mais de 8 vezes mais VEs por volume de CCM utilizado. Observámos também que a variabilidade utilizando a sUC foi 2,7 vezes superior à da SEC, evidenciando uma melhor reprodutibilidade quando se utiliza a SEC. A análise por ‘western blot’ de contaminantes de VEs de maiores dimensões revelou que a proteína HSP90B1 pode ser detetada em algumas amostras de sUC, ao passo que estava consistentemente ausente nas amostras de SEC. Em resumo, a SEC surge como um método mais prático, eficiente e consistente para o isolamento de VEs comparando com a sUC. Em termos de caraterização das VEs, o nosso trabalho revelou disparidades no tamanho das vesículas e na expressão de biomarcadores entre as diferentes linhas celulares, sublinhando a importância da seleção das linhas celulares quando se estudam VEs em mieloma múltiplo. O estudo de diferentes frações de SEC também revelou diversas concentrações de partículas e proteínas e tamanhos e expressão de marcadores variáveis em cada fração. Isto realça a influência da escolha das frações nos estudos posteriores. Além disso, os nossos resultados estabeleceram o HBS com 0.005% de Tween 20 como um tampão otimizado para o isolamento e preservação de VEs a -80°C. Uma padronização dos métodos de isolamento de pequenas VEs encontra-se em falta, e avaliações comparativas são importantes para garantir uma recuperação eficiente e reprodutível de vesículas, independentemente das aplicações a jusante. O nosso estudo destaca que a SEC supera a sUC em termos de qualidade de isolamento de VEs, oferecendo um método mais rápido e potencialmente mais fiável.
Resumo As vesículas extracelulares (VEs) são componentes-chave da comunicação intercelular em múltiplos processos fisiológicos e patológicos. Na investigação biomédica, as VEs estão a ganhar uma atenção significativa como biomarcadores de doenças e alvos terapêuticos, particularmente no desenvolvimento de cancro e de metástases. Dado o pequeno tamanho das VEs de interesse (30 a 150 nm) e o elevado risco de contaminação com VEs maiores, são necessárias técnicas de isolamento fiáveis. A ultracentrifugação (UC) é a técnica mais usada para o isolamento das vesículas, apesar de ser demorada e apresentar uma baixa reprodutibilidade. Métodos recentes como a cromatografia de exclusão de tamanho (SEC), oferecem resultados promissores, mas são necessários estudos comparativos. Neste estudo, comparámos o rendimento, a pureza e a reprodutibilidade do isolamento de VEs entre SEC, combinada com ultrafiltração, e ultracentrifugação com uma camada de sucrose (sUC). As VEs foram isoladas a partir de meio de cultura condicionado (CCM) utilizando três linhas celulares de mieloma múltiplo: MM.1S, ANBL-6 e ALMC-1. A concentração e o tamanho das partículas foram avaliados por ‘nanoparticle tracking analysis’ nanopartículas (NTA), a concentração de proteínas foi determinada por ‘bicinchoninic acid assay’ (BCA) e a presença de marcadores específicos de VEs e contaminantes não específicos foi avaliada por ‘western blot’. Os nossos resultados indicam que a SEC supera a sUC em termos de rendimento, recuperando mais de 8 vezes mais VEs por volume de CCM utilizado. Observámos também que a variabilidade utilizando a sUC foi 2,7 vezes superior à da SEC, evidenciando uma melhor reprodutibilidade quando se utiliza a SEC. A análise por ‘western blot’ de contaminantes de VEs de maiores dimensões revelou que a proteína HSP90B1 pode ser detetada em algumas amostras de sUC, ao passo que estava consistentemente ausente nas amostras de SEC. Em resumo, a SEC surge como um método mais prático, eficiente e consistente para o isolamento de VEs comparando com a sUC. Em termos de caraterização das VEs, o nosso trabalho revelou disparidades no tamanho das vesículas e na expressão de biomarcadores entre as diferentes linhas celulares, sublinhando a importância da seleção das linhas celulares quando se estudam VEs em mieloma múltiplo. O estudo de diferentes frações de SEC também revelou diversas concentrações de partículas e proteínas e tamanhos e expressão de marcadores variáveis em cada fração. Isto realça a influência da escolha das frações nos estudos posteriores. Além disso, os nossos resultados estabeleceram o HBS com 0.005% de Tween 20 como um tampão otimizado para o isolamento e preservação de VEs a -80°C. Uma padronização dos métodos de isolamento de pequenas VEs encontra-se em falta, e avaliações comparativas são importantes para garantir uma recuperação eficiente e reprodutível de vesículas, independentemente das aplicações a jusante. O nosso estudo destaca que a SEC supera a sUC em termos de qualidade de isolamento de VEs, oferecendo um método mais rápido e potencialmente mais fiável.
Descrição
Palavras-chave
size-exclusion chromatography and ultracentrifugation extracellular vesicles in Multiple Myeloma