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Publicação
Antiviral proteins targeting Influenza A hemagglutinin: design, production and characterization
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The emergence of viral pandemics highlights the need for preparedness. One of the viruses with high pandemic potential is influenza A, the causative agent of flu. This virus relies on hemagglutinin (HA) to invade host cells, making it a privileged target for antivirals. This study aimed to computationally design and experimentally validate Virus-Targeting Antibody-like scaffolds (ViTAls), capable of binding HA to block virus entry. Monobodies were used as ViTAls, small and highly stable proteins derived from fibronectin type III domain (FN3) that can be engineered to bind with high specificity and affinity to virtually any target protein. The monobodies were computationally designed using two strategies: the ‘grafting’ strategy, where a stable monobody was grafted with portions of loops from an antibody against HA; and the ‘library’ strategy, where a large pool of monobody and monobody-like motifs were selected and docked onto an epitope. In both strategies, the binding loops were subsequently re-designed to increase their binding affinity for the target, and relevant computational metrics were used to filter the results. Selected monobodies were analyzed through molecular dynamics simulations, which confirmed their structural stability. All monobodies were successfully expressed and purified, with purity ranging from 74 to 100%. The designs exhibited different degrees of thermal stability (Tm ranging from 49.4 ± 0.1 ºC to 84.6 ± 0.1 ºC) and similar aggregation profiles. Circular dichroism (CD) spectroscopy evaluated the secondary structure, revealing similar spectral features across the monobodies. Additionally, the monobodies target, hemagglutinin was expressed, purified, and characterized. The functional characterization of monobodies was performed with qualitative binding affinity assays using fluidics-free surface plasmon resonance (SPR) and some monobodies showed interaction with HA. Therefore, this study contributes to the computational design and experimental validation of novel monobodies that target influenza A hemagglutinin, which can be a flexible approach against emerging pandemics.
O surgimento de pandemias virais destaca a necessidade de preparação. O vírus Influenza A, causador da gripe, possui elevado potencial pandémico e depende da hemaglutinina (HA) para invadir as células hospedeiras, tornando-a um alvo privilegiado para antivirais. Este estudo teve como objetivo desenhar computacionalmente e validar experimentalmente estruturas semelhantes a anticorpos (ViTAls), capazes de se ligar à HA e bloquear a entrada viral. Utilizaram-se monobodies como ViTAls, proteínas pequenas e estáveis derivadas do domínio da fibronectina tipo III (FN3) que podem ser desenhadas para se ligarem especificamente a proteínas-alvo. Os monobodies foram desenhados computacionalmente através de duas estratégias: um monobody estável foi enxertado com partes de loops de um anticorpo contra a HA; e um grande conjunto de estruturas de monobodies ou semelhantes, uma biblioteca de monobodies, foram selecionadas e acopladas a um epítopo. Para ambas as estratégias, os loops de ligação foram posteriormente redesenhados para aumentar a afinidade de ligação ao alvo e métricas computacionais relevantes foram utilizadas para filtrar os resultados. Simulações de dinâmica molecular confirmaram a estabilidade conformacional dos monobodies selecionados. Os monobodies foram expressos e purificados com sucesso, com uma percentagem de pureza entre os 74 e os 100%. Os designs demonstraram diferentes graus de estabilidade térmica (Tm entre 49.4 ± 0.1 e 84.6 ± 0.1 ºC) e perfis de agregação semelhantes. A espetroscopia de dicroísmo circular (CD) avaliou a estrutura secundária, revelando características espetrais semelhantes entre os monobodies. Adicionalmente, a hemaglutinina foi expressa, purificada e caracterizada. A caracterização funcional dos monobodies foi realizada com ensaios qualitativos de afinidade de ligação através de ressonância plasmónica de superfície (SPR) sem fluídica e alguns monobodies apresentaram interação com HA. Portanto, este estudo contribui para o design computacional e validação experimental de novos monobodies direcionados à hemaglutinina, podendo esta ser uma abordagem flexível contra pandemias emergentes.
O surgimento de pandemias virais destaca a necessidade de preparação. O vírus Influenza A, causador da gripe, possui elevado potencial pandémico e depende da hemaglutinina (HA) para invadir as células hospedeiras, tornando-a um alvo privilegiado para antivirais. Este estudo teve como objetivo desenhar computacionalmente e validar experimentalmente estruturas semelhantes a anticorpos (ViTAls), capazes de se ligar à HA e bloquear a entrada viral. Utilizaram-se monobodies como ViTAls, proteínas pequenas e estáveis derivadas do domínio da fibronectina tipo III (FN3) que podem ser desenhadas para se ligarem especificamente a proteínas-alvo. Os monobodies foram desenhados computacionalmente através de duas estratégias: um monobody estável foi enxertado com partes de loops de um anticorpo contra a HA; e um grande conjunto de estruturas de monobodies ou semelhantes, uma biblioteca de monobodies, foram selecionadas e acopladas a um epítopo. Para ambas as estratégias, os loops de ligação foram posteriormente redesenhados para aumentar a afinidade de ligação ao alvo e métricas computacionais relevantes foram utilizadas para filtrar os resultados. Simulações de dinâmica molecular confirmaram a estabilidade conformacional dos monobodies selecionados. Os monobodies foram expressos e purificados com sucesso, com uma percentagem de pureza entre os 74 e os 100%. Os designs demonstraram diferentes graus de estabilidade térmica (Tm entre 49.4 ± 0.1 e 84.6 ± 0.1 ºC) e perfis de agregação semelhantes. A espetroscopia de dicroísmo circular (CD) avaliou a estrutura secundária, revelando características espetrais semelhantes entre os monobodies. Adicionalmente, a hemaglutinina foi expressa, purificada e caracterizada. A caracterização funcional dos monobodies foi realizada com ensaios qualitativos de afinidade de ligação através de ressonância plasmónica de superfície (SPR) sem fluídica e alguns monobodies apresentaram interação com HA. Portanto, este estudo contribui para o design computacional e validação experimental de novos monobodies direcionados à hemaglutinina, podendo esta ser uma abordagem flexível contra pandemias emergentes.
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Palavras-chave
Influenza A Hemagglutinin Virus-Targeting Antibody-like scaffolds ViTAls monobodies fibronectin type III domain (FN3)