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Publicação
Stabilization and conformational selectivity induced by small molecules: insights from the BCL2 RNA G-Quadruplex
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Orientador(es)
Resumo(s)
Within 5′ untranslated regions (5′ UTRs), RNA G-quadruplexes (G4s) can form as non-canonical secondary structures that regulate protein expression. Since protein dysregulation contributes to diverse diseases, RNA G4s are increasingly considered promising targets for therapeutic intervention. Small molecules offer a particularly attractive approach for modulating RNA G4 function, as they can alter G4 stability and accessibility. Among potential targets, the conserved G4 in the 5′ UTR of BCL2 mRNA (BCL2Q) is especially relevant, as it regulates the apoptosis factor BCL-2; its misregulation is linked to cancer and neurodegenerative disease, and thus represents a promising focus for therapeutic development.
This thesis aimed to investigate how small molecules influence the stability, binding properties, and conformational dynamics of BCL2Q. From a panel of candidate G4 binders, identified by literature and initial screenings, four compounds – nitidine, berberine, Pt-tripod, and TMPyP4 – emerged as promising candidates. Further in-depth characterization demonstrated that all four stabilized BCL2Q and exhibited a preferred 1:2 G4:ligand stoichiometry. Among them, TMPyP4 provided the strongest stabilization, increasing the melting temperature by more than 30 °C, and displayed the clearest selective binding to one specific BCL2Q conformer as revealed by nuclear magnetic resonance spectroscopy, providing the first evidence of ligand discrimination among RNA G-quadruplex conformations of the same topology. Using a simplified construct, TMPyP4 binding was found to depend on pH, leading to changes in G4:ligand binding behavior consistent with protonation.
These findings identified TMPyP4 as a high-affinity, conformation-selective stabilizer of BCL2Q. More broadly, they suggest that conformational selectivity may represent a novel and important principle for modulating RNA G-quadruplexes and their associated biological functions, providing mechanistic insights valuable for RNA-targeted therapeutics aimed at regulating BCL-2 expression.
Nas regiões não traduzidas 5′ (5′ UTRs), os RNA G-quadruplexes (G4s) podem formar estruturas secundárias não canónicas que regulam a expressão proteica. Como a desregulação proteica contribui para diversas doenças, os RNA G4 são cada vez mais considerados como alvos promissores para intervenção terapêutica. Moléculas pequenas oferecem uma abordagem particularmente atraente para modular a função dos RNA G4, pois podem alterar a estabilidade e a acessibilidade dos G4. Entre os potenciais alvos, o G4 conservado na região 5′ UTR do mRNA de BCL2 (BCL2Q) é especialmente relevante, pois regula o fator de apoptose BCL-2; a sua desregulação está associada ao cancro e a doenças neurodegenerativas, representando assim um foco promissor para o desenvolvimento terapêutico. Esta tese teve como objetivo investigar como pequenas moléculas influenciam a estabilidade, propriedades de ligação e a dinâmica conformacional do BCL2Q. A partir de um painel de possíveis ligandos de G4, identificados pela literatura e triagem inicial, quatro compostos – nitidina, berberina, Pt-tripod e TMPyP4 – surgiram como candidatos promissores. Caracterizações aprofundadas demonstraram que os quatro estabilizavam o BCL2Q e exibiram uma estequiometria preferencial de 1:2 G4:ligando. Entre eles, o TMPyP4 proporcionou a maior estabilização, aumentando a temperatura de fusão em mais de 30 °C, e apresentou uma clara ligação seletiva a uma conformação específica do BCL2Q, revelada por espectroscopia de ressonância magnética nuclear, fornecendo a primeira evidência de discriminação por uma molécula pequena entre conformações de RNA G-quadruplex com a mesma topologia. Usando um construto simplificado, a ligação do TMPyP4 foi encontrada como dependente do pH, levando a alterações no comportamento da interação G4:ligando consistentes com protonação. Estes dados identificaram o TMPyP4 como um estabilizador seletivo e de alta afinidade para uma conformação do BCL2Q. De forma mais ampla, sugerem que a seletividade conformacional pode representar um princípio novo e importante para modular RNA G-quadruplexes e as suas funções biológicas associadas, fornecendo conhecimento mecanístico valioso para terapêuticas direcionadas a RNA visando regular a expressão de BCL-2.
Nas regiões não traduzidas 5′ (5′ UTRs), os RNA G-quadruplexes (G4s) podem formar estruturas secundárias não canónicas que regulam a expressão proteica. Como a desregulação proteica contribui para diversas doenças, os RNA G4 são cada vez mais considerados como alvos promissores para intervenção terapêutica. Moléculas pequenas oferecem uma abordagem particularmente atraente para modular a função dos RNA G4, pois podem alterar a estabilidade e a acessibilidade dos G4. Entre os potenciais alvos, o G4 conservado na região 5′ UTR do mRNA de BCL2 (BCL2Q) é especialmente relevante, pois regula o fator de apoptose BCL-2; a sua desregulação está associada ao cancro e a doenças neurodegenerativas, representando assim um foco promissor para o desenvolvimento terapêutico. Esta tese teve como objetivo investigar como pequenas moléculas influenciam a estabilidade, propriedades de ligação e a dinâmica conformacional do BCL2Q. A partir de um painel de possíveis ligandos de G4, identificados pela literatura e triagem inicial, quatro compostos – nitidina, berberina, Pt-tripod e TMPyP4 – surgiram como candidatos promissores. Caracterizações aprofundadas demonstraram que os quatro estabilizavam o BCL2Q e exibiram uma estequiometria preferencial de 1:2 G4:ligando. Entre eles, o TMPyP4 proporcionou a maior estabilização, aumentando a temperatura de fusão em mais de 30 °C, e apresentou uma clara ligação seletiva a uma conformação específica do BCL2Q, revelada por espectroscopia de ressonância magnética nuclear, fornecendo a primeira evidência de discriminação por uma molécula pequena entre conformações de RNA G-quadruplex com a mesma topologia. Usando um construto simplificado, a ligação do TMPyP4 foi encontrada como dependente do pH, levando a alterações no comportamento da interação G4:ligando consistentes com protonação. Estes dados identificaram o TMPyP4 como um estabilizador seletivo e de alta afinidade para uma conformação do BCL2Q. De forma mais ampla, sugerem que a seletividade conformacional pode representar um princípio novo e importante para modular RNA G-quadruplexes e as suas funções biológicas associadas, fornecendo conhecimento mecanístico valioso para terapêuticas direcionadas a RNA visando regular a expressão de BCL-2.