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Publicação
Expressão em Escherichia coli de antigénios do Cell fusing agent virus (Flaviviridae: Flavivirus) como proteína de fusão
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Resumo(s)
RESUMO: O Cell Fusing Agent Vírus (CFAV), considerado como o primeiro “flavivírus
específicos de insectos” (ISF), parece estar exclusivamente adaptado aos seus
hospedeiros, não replicando em células de vertebrados. Apesar de ter sido identificado
há mais de três décadas (1975), a verdade é que muito pouco se conhece sobre a sua
biologia. Dado o seu parentesco filogenético com alguns outros flavivírus encontrados
naturalmente em mosquitos de diferentes géneros colhidos em diferentes regiões do
globo, este vírus poderá ser usado como modelo para o estudo de ISF. No entanto,
necessitam do desenvolvimento de ferramentas básicas, tais como clones moleculares
ou baterias de soros contendo anticorpos que reconheçam uma ou mais proteínas
codificadas pelo genoma viral, produzidas, por exemplo, a partir de antigénios virais
produzidos de forma recombinante.
Com este trabalho pretendeu-se a optimização de protocolos que permitiram a
expressão e purificação parcial de quatro proteínas [duas proteínas estruturais (C e E) e duas não estruturais (NS3hel e NS5B)] do CFAV em E. coli, todas elas produzidas
como proteínas de fusão com “caudas” (tags) de hexahistidina nos seus extremos
carboxilo.
Para a expansão do CFAV foram utilizadas células Aedes albopictus (C6/36).
Após a realização da extracção do RNA viral e a obtenção de cDNA, procedeu-se
amplificação, por RT-PCR, das regiões codificantes das proteínas C, E, NS3hel e
NS5B, utilizando primers específicos. Os quatro fragmentos de DNA foram
independentemente inseridos no vector pJTE1.2/blunt usando E. coli NovaBlue como
hospedeira de clonagem e, posteriormente, inseridos em vectores de expressão pET-28b
e pET-29b usando E. coli BL21(DE3)pLysS e Rosetta(DE3)pLysS como hospedeiras de
expressão.
Após da indução, expressão e purificação das proteínas recombinantes C, E, NS3hel e NS5B, foi confirmada a autenticidade destas proteínas produzidas através do método Western Blot com um anticorpo anti-histidina. --------- ABSTRACT: The Cell Fusing Agent virus (CFAV) considered as the first "insect- specific
flavivirus" (ISF) and seems to be uniquely adapted to their hosts, not replicating in
vertebrate cells. Although it has been known for more than three decades (1975), the
truth is very little is known about its biology. Given its close phylogenetic relationship with other flavivirus naturally circulating in various genera of mosquitoes collected from different regions of the globe, this virus could be used as a model for the study of ISF. However, such studies require the development of experimental basic tools, such as molecular clones or serum batteries containing antibodies that recognize one or more proteins encoded by the viral genome, produced, for example, from viral antigens recombinant produced.
In this work, we carried out the optimization of protocols that allowed the
expression and partial purification of four proteins [two structural proteins (C and E)
and two nonstructural proteins (NS3hel and NS5B)] CFAV in E. coli as fusion protein
for c-terminal hexahistidine tags.
For the expansion of the CFAV we used Aedes albopictus (C6/36) cells. After completion of the viral RNA extraction and cDNA obtained, amplification of the coding
regions of the C, E, NS5B and NS3hel proteins was carried out by RT-PCR using
specific primers. The four DNA fragments were independently inserted into the vector
pJTE1.2/blunt using E. coli NovaBlue as cloning host and then inserted into expression vectors pET-28b and pET-29b using E. coli BL21(DE3)pLysS and Rosetta(DE3)pLysS
as expression host.
After induction, expression and purification of recombinant C, E, NS3hel and NS5B proteins Western Blot analyses with an anti-histidine antibody confirmed the
authenticity of these proteins produced.
Descrição
Palavras-chave
Escherichia coli - physiology Cell Fusion Flavivirus Viral Fusion Proteins Microbiologia e Parasitologia
Contexto Educativo
Citação
Editora
Faculdade de Ciências Médicas. UNL