Publicação
Detection and inhibition of β-lactamase activity in clinical isolates of Escherichia coli combining β-lactamase and efflux inhibitors using an MTT-based method: phenotypic and genotypic validation
| datacite.subject.fos | Ciências Médicas | pt_PT |
| dc.contributor.advisor | Machado, Diana | |
| dc.contributor.advisor | Viveiros, Miguel | |
| dc.contributor.author | Serra, Débora Carvalho | |
| dc.date.accessioned | 2020-05-07T16:01:44Z | |
| dc.date.available | 2023-04-01T00:30:41Z | |
| dc.date.issued | 2020-03-09 | |
| dc.date.submitted | 2020-05-07 | |
| dc.description.abstract | RESUMO: A resistência aos antibióticos é uma ameaça cada vez maior na era da medicina moderna, na qual a resistência aos β-lactâmicos se tornou um tema premente uma vez que é a classe de antibióticos mais usada na clínica. Escherichia coli neutraliza os β-lactâmicos através da produção de β-lactamases, no entanto, a actividade de efluxo e redução da expressão de porinas também contribuem para este fenótipo de resistência. Neste trabalho, pretendemos optimizar um método colorimétrico económico para a detecção rápida de β-lactamases AmpC, β-lactamases de largo espectro (ESBLs), metallo-β-lactamases (MBLs), e carbapenemases, bem como a detecção simultânea de actividade de efluxo em E. coli para uso de rotina. As 27 estirpes clínicas de E. coli estudadas foram genotipadas por ERIC-PCR. A susceptibilidade aos antibióticos foi avaliada por Kirby-Bauer. As concentrações mínimas inibitórias (CMIs) dos β-lactâmicos foram determinadas na presença e ausência dos seguintes inibidores específicos de β-lactamases: cloxacillina para AmpC; clavulanato para ESBLs; EDTA para MBLs e ácido borónico para carbapenemases. As CMIs dos βlactâmicos foram também realizadas na presença e ausência dos inibidores de efluxo clorpromazina, “phearg-β-naphthylamide” (PAβN) e “carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone” (CCCP) em combinação com os inibidores de β-lactamases. As CMIs foram efectuadas usando o método de microdiluição em placa de 96 poços e MTT para detecção colorimétrica. Os resultados foram validados usando os métodos fenotípicos padrão para detecção de β-lactamases por difusão em disco e a detecção de genes que codificam βlactamases. A produção de β-lactamasesfoi detectada em todas as estirpes clínicas e incluiu a presença de AmpC, TEM com OXA-1, SHV, ou CTX-M ou sobrexpressão de AmpC. Foi possível reduzir as CMIs dos β-lactâmicos na presença dos inibidores de efluxo em combinação com os inibidores de β-lactamases demonstrando que, apesar da presença de β-lactamases, as CMIs dos β-lactâmicos podem ser reduzidas na presença de inibidores de efluxo. Neste trabalho, optimizámos um método para a detecção simultânea de β-lactamases AmpC, ESBLs, MBLs, carbapenemases e actividade de efluxo. Este método apresenta potencialidade para ser usado em países em desenvolvimento uma vez que é um método de fácil execução e não necessita de reagentes dispendiosos nem de equipamento especializado. Quando associado ao uso de um composto colorimétrico para a detecção, como o MTT, a interpretação dos resultados é directa uma vez que não está dependente do operador, evitando deste modo resultados falso-negativos bem como falsos-positivos. Baseado nos resultados obtidos, o efeito sinérgico observado entre inibidores de β-lactamases e inibidores de efluxo sugere um aumento da concentração de β-lactâmicos no interior da célula, aumentando assim a sua acção bactericida. | pt_PT |
| dc.description.abstract | ABSTRACT: Antimicrobial resistance is an ever-increasing threat in the era of modern medicine, of which resistance to β-lactams has become an urgent issue as they are the most common used antibiotics. Escherichia coli counteracts β-lactams with production of β-lactamases, however efflux mechanisms and porins have been known to contribute to this resistance phenotype. In this work, we aim to establish a costeffective colorimetric method for the fast screening of β-lactamases AmpC, extended spectrum β-lactamases (ESBLs), metallo-β-lactamases (MBLs), carbapenemases and the simultaneous presence of increased efflux activity in E. coli for routine use. The 27 E. coli clinical strains studied were typed by ERIC-PCR. Drug susceptibility was assessed by Kirby-Bauer. Minimum inhibitory concentrations (MICs) of β-lactams were performed in presence and absence the following β-lactamase-specific inhibitors: cloxacillin for AmpC; clavulanate for ESBLs; EDTA for MBLs and boronic acid for carbapenemases. MICs of β-lactams were also performed in presence and absence the efflux inhibitors chlorpromazine, phe-arg-β-naphthylamide (PAβN) and carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone (CCCP) in combination with the β-lactamase-specific inhibitors. MICs were done using the 96-well plate microdilution method and MTT for colorimetric detection. The results were validated using the phenotypic standard methods for β-lactamases detection by disc diffusion and the screening of genes coding β-lactamases. β-lactamase production was detected in all clinical strains and included the presence of AmpC, TEM with OXA-1, SHV, or CTX-M or AmpC overexpression. We were able to reduce the MICs of β-lactams in the presence of the efflux inhibitors in combination with the β-lactamase-specific inhibitors demonstrating that despite the presence β-lactamases, the MICs of β-lactams can be reduced in the presence of efflux inhibitors. In this work we optimize a method for the simultaneous detection of β-lactamases AmpC, ESBLs, MBLs, carbapenemases and efflux activity. This method has the potential to be used in low-income countries since does not require expensive reagents nor specialized equipment. When used in association with a colorimetric reagent for the detection, as MTT, the interpretation of the results is straightforward being independent of the operator, avoiding false-negative as well false-positive results. Based on the results obtained, the synergistic effect observed between β-lactamase inhibitors and efflux pump inhibitors suggest the accumulation of β-lactams within the bacteria, thus potentiating their bactericide action. | pt_PT |
| dc.identifier.tid | 202480925 | pt_PT |
| dc.identifier.uri | http://hdl.handle.net/10362/97300 | |
| dc.language.iso | eng | pt_PT |
| dc.subject | Escherichia coli | pt_PT |
| dc.subject | β-lactâmicos | pt_PT |
| dc.subject | β-lactamases | pt_PT |
| dc.subject | Bombas de efluxo | pt_PT |
| dc.subject | Inibidores de efluxo | pt_PT |
| dc.subject | MTT | pt_PT |
| dc.subject | Escherichia coli | pt_PT |
| dc.subject | β-lactams | pt_PT |
| dc.subject | β-lactamases | pt_PT |
| dc.subject | Efflux pumps | pt_PT |
| dc.subject | Efflux inhibitors | pt_PT |
| dc.subject | MTT | pt_PT |
| dc.title | Detection and inhibition of β-lactamase activity in clinical isolates of Escherichia coli combining β-lactamase and efflux inhibitors using an MTT-based method: phenotypic and genotypic validation | pt_PT |
| dc.type | master thesis | |
| dspace.entity.type | Publication | |
| oaire.awardNumber | UID/Multi/04413/2013 | |
| oaire.awardURI | info:eu-repo/grantAgreement/FCT/5876/UID%2FMulti%2F04413%2F2013/PT | |
| oaire.fundingStream | 5876 | |
| project.funder.identifier | http://doi.org/10.13039/501100001871 | |
| project.funder.name | Fundação para a Ciência e a Tecnologia | |
| rcaap.rights | openAccess | pt_PT |
| rcaap.type | masterThesis | pt_PT |
| relation.isProjectOfPublication | a1a61bf4-bb19-434c-ae0c-4c12ff5d2915 | |
| relation.isProjectOfPublication.latestForDiscovery | a1a61bf4-bb19-434c-ae0c-4c12ff5d2915 | |
| thesis.degree.name | Mestrado em Microbiologia Médica | pt_PT |
Ficheiros
Principais
1 - 1 de 1
A carregar...
- Nome:
- Serra, Debora DM 2020.pdf
- Tamanho:
- 1.44 MB
- Formato:
- Adobe Portable Document Format