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Publicação
Phenylalanine hydroxylase (pah) enzymosomes : development of a nanosystem for enzyme substitution/replacement therapies
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Autores
Orientador(es)
Resumo(s)
Abstract An impaired activity of human phenylalanine hydroxylase (hPAH) results in
phenylketonuria (PKU). To prevent the psycho-motor deficits developed by PKU
patients, treatment must be initiated as soon as possible after birth. Presently, dietary
restriction, BH4 supplementation and enzyme substitution therapy are available.
Technological advances in the production of recombinant human proteins boosted
the development of enzyme reposition therapies. Although very promising, in the
case of PKU their use implies preservation of hPAH activity and 3D structure during
the formulation process. Due to the observed conformational instability, formulation
of the 200 kDa homotetrameric cytoplasmatic enzyme as an active pharmaceutical
ingredient (enzyme reposition therapy; ERT) is a very challenging process.
hPAH-enzymosomes may be a desirable formulation to use as an ERT for PKU
treatment. In this system the enzyme is covalently attached to the outer surface of
liposome conferring protection from degradation, long-circulating properties, and
lower immunogenicity.
Preliminary data obtained by our group indicated that modification of hPAH lysine
residues with N-succinimidyl S-acethylthioacetate (SATA) to allow the covalent
reaction with the liposomal system preserve enzymatic activity. In this work, hPAH
modification conditions were optimized using different molar ratios of SATA:hPAH.
Study of modified hPAH was performed regarding enzymatic activity,
thermostability and quaternary structure. As the SATA:hPAH molar ratio increased a
decrease in the recovered protein with a slight decrease in enzyme activity
concomitant to a change in the oligomeric state was observed. Using the selected
ratios, the storage conditions were evaluated, and it was possible to conclude that the
enzyme preserved its enzymatic activity and without significant loss in terms of
protein content, and therefore, successful functional enzymosomes were obtained.
The optimization of the enzymosome preparation process,, which must be
thoroughly documented in terms of stability and effectiveness tests to confirm the
maintenance of functional features, must be the subject of further research.
Resumo: Uma atividade deficiente da fenilalanina hidroxilase humana (hPAH) resulta em fenilcetonúria (PKU). Para prevenir o grave atraso psico-motor desenvolvido pelos doentes, o tratamento deve ser iniciado o mais rapidamente possível após o nascimento. Atualmente, a restrição dietética, a suplementação BH4 e a terapia de substituição enzimática estão disponíveis. Os avanços tecnológicos na produção de proteínas recombinantes impulsionaram o desenvolvimento de terapias de reposição enzimática. Embora muito promissor, no caso da PKU a sua utilização implica a preservação da atividade e estrutura 3D da hPAH, durante o processo de formulação. Devido à instabilidade conformacional observada, a formulação da enzima citoplasmática homotetramérica de 200 kDa como ingrediente farmacêutico ativo (terapia de reposição enzimática; ERT) é um processo muito desafiante. Enzimossomas de hPAH podem ser uma formulação desejável para usar como ERT para o tratamento PKU. Neste sistema, a enzima é ligada ao lipossoma que confere proteção contra a degradação, propriedades de longa circulação e menor imunogenicidade. Dados preliminares obtidos pelo grupo indicaram que a modificação de resíduos de lisina de hPAH com N-succinimidyl S-acethylthioacetate (SATA) permitiu a preservação da atividade. Neste trabalho, as condições de modificação da hPAH foram otimizadas utilizando diferentes rácios molares de SATA:hPAH. O estudo da hPAH modificado foi caracterizado relativamente à atividade enzimática, termostabilidade e estrutura quaternária. Com o aumento do rácio molar SATA:hPAH verificou-se uma diminuição da proteína recuperada com uma ligeira diminuição da atividade enzimática acompanhada de uma mudança no estado de oligomerização. Utilizando a condição selecionada, as condições de armazenamento foram avaliadas e foi possível concluir que a enzima preservou a sua atividade e sem perda significativa de proteína, e assim obtendo-se enzimossomas funcionais Estudos futuros incluem, a otimização do processo de produção de enzimosomas, que deve ser completamente estudada em termos de estabilidade e eficácia para confirmar a manutenção das características funcionais.
Resumo: Uma atividade deficiente da fenilalanina hidroxilase humana (hPAH) resulta em fenilcetonúria (PKU). Para prevenir o grave atraso psico-motor desenvolvido pelos doentes, o tratamento deve ser iniciado o mais rapidamente possível após o nascimento. Atualmente, a restrição dietética, a suplementação BH4 e a terapia de substituição enzimática estão disponíveis. Os avanços tecnológicos na produção de proteínas recombinantes impulsionaram o desenvolvimento de terapias de reposição enzimática. Embora muito promissor, no caso da PKU a sua utilização implica a preservação da atividade e estrutura 3D da hPAH, durante o processo de formulação. Devido à instabilidade conformacional observada, a formulação da enzima citoplasmática homotetramérica de 200 kDa como ingrediente farmacêutico ativo (terapia de reposição enzimática; ERT) é um processo muito desafiante. Enzimossomas de hPAH podem ser uma formulação desejável para usar como ERT para o tratamento PKU. Neste sistema, a enzima é ligada ao lipossoma que confere proteção contra a degradação, propriedades de longa circulação e menor imunogenicidade. Dados preliminares obtidos pelo grupo indicaram que a modificação de resíduos de lisina de hPAH com N-succinimidyl S-acethylthioacetate (SATA) permitiu a preservação da atividade. Neste trabalho, as condições de modificação da hPAH foram otimizadas utilizando diferentes rácios molares de SATA:hPAH. O estudo da hPAH modificado foi caracterizado relativamente à atividade enzimática, termostabilidade e estrutura quaternária. Com o aumento do rácio molar SATA:hPAH verificou-se uma diminuição da proteína recuperada com uma ligeira diminuição da atividade enzimática acompanhada de uma mudança no estado de oligomerização. Utilizando a condição selecionada, as condições de armazenamento foram avaliadas e foi possível concluir que a enzima preservou a sua atividade e sem perda significativa de proteína, e assim obtendo-se enzimossomas funcionais Estudos futuros incluem, a otimização do processo de produção de enzimosomas, que deve ser completamente estudada em termos de estabilidade e eficácia para confirmar a manutenção das características funcionais.
Descrição
Palavras-chave
Phenylalanine hydroxylase Phenylketonuria Enzyme reposition therapy Enzymosomes