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Publicação
Development of new class of precision antibiotics against multidrug resistant klebsiella pneumoniae
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Orientador(es)
Resumo(s)
Abstract: The increasing global trend in antimicrobial resistance represents a major public health threat in modern medicine worldwide. Among clinically concerning pathogens are Multidrug resistant (MDR) Klebsiella pneumoniae, classified by the World Health Organization (WHO) as a critical priority pathogen underscoring the urgent need for new antibiotics drugs. In this study we aimed to evaluate the in vitro antimicrobial activity of a novel antimicrobial candidate, the metallic complex (OMKP-3), against MDR K. pneumoniae. The antimicrobial activity wastested by determining OMKP-3 minimal inhibitory concentrations (MIC, MIC50 and MIC90) and minimal bactericidal concentrations (MBC) through broth microdilution and cell viability assays. OMKP-3 bactericidal activity was characterized by time-kill assays and its spectrum of activity and antibiofilm potential was assessed. OMKP 3 permeation across K. pneumoniae cell envelope, was tested by checkerboard assays combining OMKP-3 with either polymyxin B (PMB) or RND efflux pump inhibitor PaβN. Moreover, we tested its effect on membrane permeability by fluorescence microscopy (SYTO9/PI). To explore OMKP-3 mechanism of action, K. pneumoniae was exposed to increasing OMKP-3 concentrations, and mutations were identified by comparison between the wild-type and resistant strains and OMKP-3 intracellular location was determined by Inductively coupled plasma atomic emission spectroscopy (ICP-AES). Additionally, OMKP-3 cytotoxicity was assessed against a mammalian cell line (V79) by MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyltetrazolium bromide) assays. OMKP-3 exhibited high antimicrobial activity (MIC =6.25µg/mL), with an estimated MIC50 and MIC90 (n=47 MDR K. pneumoniae strains) of 25 µg/mL and 50 µg/mL, respectively. This complex exhibited bactericidal activity (MBC=12.5 µg/mL) and at 8xMIC it completely eradicated K. pneumoniae within 2 hours. OMKP-3 demonstrated to be equally active against other clinically important Gram-negative pathogens (MIC=6.25-25µg/mL). The complex was additionally able to prevent K. pneumoniae biofilms with 25 to 50 µg/mL. OMKP-3 acted synergistically with PMB (FIC=0.375), and its activity wasn’t affected by PaβN. Regarding OMKP-3-resistant mutants, missense mutations were mainly located in transport-associated proteins specialized with metabolites uptake and energy production (Methionine ABC transporter system and the Oxaloacetate decarboxylase Na+ pump system). OMKP-3 was found across all cellular fractions both in wild-type and resistant strains. Moreover, OMKP-3 was non-cytotoxic against mammalian cells ([OMKP-3] 16xMIC; cell viability >74% (24 h)). Our results revealed that OMKP-3 stands out as a promising antibacterial candidate, exhibiting rapid bactericidal action, antibiofilm potential and low toxicity. Additionally, our findings suggest that OMKP-3 might exhibit a novel mechanism of action. These results position OMKP-3 as an excellent candidate for the development of a safe and effective antibacterial therapy.
Resumo: O crescimento global da resistência antimicrobiana representa um risco para a saúde pública a nível global. A bactéria Klebsiella pneumoniae multirresistente (MDR), em particular, é considerada uma das maiores ameaças, tendo sido classificada como uma “prioridade crítica” para o desenvolvimento de novos antibióticos pela Organização Mundial da Saúde (OMS). Neste estudo avaliou-se a atividade antimicrobiana, in vitro, de um novo complexo metálico (OMKP 3), contra K. pneumoniae MDR. Com este objetivo, determinou-se as concentrações mínimas inibitórias(CMI, CMI50 e CMI90) e as concentrações mínimas bactericidas (CMB) de OMKP-3, utilizando ensaios de microdiluição e de viabilidade. A atividade de OMKP-3 foi caracterizada através de ensaios de “time-kill”, e o seu espectro de atividade e potencial anti-biofilme foram avaliados. A capacidade de OMKP-3 atravessar a membrana celular foi testada por ensaios de “checkerboard” em combinação com a polimixina B (PMB) e o inibidor de bombas de efluxo PaβN. Averiguou-se ainda o seu efeito na permeabilidade das membranas celulares por microscopia de fluorescência (SYTO9/PI). Para explorar o seu mecanismo de ação, K. pneumoniae foi exposta a concentrações crescentes de OMKP-3, e identificadas mutações através da comparação das estirpes mãe selvagens com as resistentes. Determinou-se ainda a sua localização intracelular por Espectrometria de emissão atómica por plasma acoplado indutivamente (ICP-AES). Por fim, a citotoxicidade de OMKP-3 foi avaliada numa linha celular de mamífero (V79) através de ensaios MTT (3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide). OMKP-3 demonstrou uma elevada atividade antimicrobiana contra K. pneumoniae MDR (CMI=6.25 µg/mL), com CMI50 e CMI90 estimados de 25 µg/mL e 50 µg/mL, respetivamente. Este complexo exibiu atividade bactericida (MBC=12.5 µg/mL) e a 8xCMI erradicou K. pneumoniae em 2h. OMKP-3 demonstrou ser igualmente ativo contra outros patógenos humanos Gram-negativos (MIC=6.25-25 µg/mL). Este complexo metálico permitiu ainda prevenir a formação de biofilmes de K. pneumoniae às concentrações de 25 a 50 µg/mL. OMKP-3 agiu sinergicamente com PMB (FIC=0.375), mas a sua atividade não foi afetada pelo PaβN. Os mutantes resistentes, tinham mutações “missense” em proteínas de transporte de metabolitos (transportador ABC de metionina) e essenciais na produção de energia (bomba Na+ Oxaloacetato decarboxilase). OMKP-3 foi encontrado em todas as frações celulares. Adicionalmente, OMKP-3 não foi citotóxico contra células de mamíferos ([OMKP-3] 16xMIC, viabilidade celular> 74% (24h)). Os nossos resultados indicaram que o OMKP-3 é um antimicrobiano promissor, demonstrando, simultaneamente, uma rápida atividade bactericida, potencial anti-biofilme e baixa toxicidade. Além disso, poderá exibir um novo mecanismo de ação. Estes resultados sugerem que o OMKP-3 é um excelente candidato ao desenvolvimento de um antibiótico eficaz e seguro no tratamento de infeções bacterianas.
Resumo: O crescimento global da resistência antimicrobiana representa um risco para a saúde pública a nível global. A bactéria Klebsiella pneumoniae multirresistente (MDR), em particular, é considerada uma das maiores ameaças, tendo sido classificada como uma “prioridade crítica” para o desenvolvimento de novos antibióticos pela Organização Mundial da Saúde (OMS). Neste estudo avaliou-se a atividade antimicrobiana, in vitro, de um novo complexo metálico (OMKP 3), contra K. pneumoniae MDR. Com este objetivo, determinou-se as concentrações mínimas inibitórias(CMI, CMI50 e CMI90) e as concentrações mínimas bactericidas (CMB) de OMKP-3, utilizando ensaios de microdiluição e de viabilidade. A atividade de OMKP-3 foi caracterizada através de ensaios de “time-kill”, e o seu espectro de atividade e potencial anti-biofilme foram avaliados. A capacidade de OMKP-3 atravessar a membrana celular foi testada por ensaios de “checkerboard” em combinação com a polimixina B (PMB) e o inibidor de bombas de efluxo PaβN. Averiguou-se ainda o seu efeito na permeabilidade das membranas celulares por microscopia de fluorescência (SYTO9/PI). Para explorar o seu mecanismo de ação, K. pneumoniae foi exposta a concentrações crescentes de OMKP-3, e identificadas mutações através da comparação das estirpes mãe selvagens com as resistentes. Determinou-se ainda a sua localização intracelular por Espectrometria de emissão atómica por plasma acoplado indutivamente (ICP-AES). Por fim, a citotoxicidade de OMKP-3 foi avaliada numa linha celular de mamífero (V79) através de ensaios MTT (3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide). OMKP-3 demonstrou uma elevada atividade antimicrobiana contra K. pneumoniae MDR (CMI=6.25 µg/mL), com CMI50 e CMI90 estimados de 25 µg/mL e 50 µg/mL, respetivamente. Este complexo exibiu atividade bactericida (MBC=12.5 µg/mL) e a 8xCMI erradicou K. pneumoniae em 2h. OMKP-3 demonstrou ser igualmente ativo contra outros patógenos humanos Gram-negativos (MIC=6.25-25 µg/mL). Este complexo metálico permitiu ainda prevenir a formação de biofilmes de K. pneumoniae às concentrações de 25 a 50 µg/mL. OMKP-3 agiu sinergicamente com PMB (FIC=0.375), mas a sua atividade não foi afetada pelo PaβN. Os mutantes resistentes, tinham mutações “missense” em proteínas de transporte de metabolitos (transportador ABC de metionina) e essenciais na produção de energia (bomba Na+ Oxaloacetato decarboxilase). OMKP-3 foi encontrado em todas as frações celulares. Adicionalmente, OMKP-3 não foi citotóxico contra células de mamíferos ([OMKP-3] 16xMIC, viabilidade celular> 74% (24h)). Os nossos resultados indicaram que o OMKP-3 é um antimicrobiano promissor, demonstrando, simultaneamente, uma rápida atividade bactericida, potencial anti-biofilme e baixa toxicidade. Além disso, poderá exibir um novo mecanismo de ação. Estes resultados sugerem que o OMKP-3 é um excelente candidato ao desenvolvimento de um antibiótico eficaz e seguro no tratamento de infeções bacterianas.
Descrição
Palavras-chave
MDR K. pneumoniae Antibiotic resistance Iridium complex Antimicrobial activity Mechanism of action