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Publicação
Plasmonic Nanostars for Sensitive SERS-based Glial Fibrillary Acidic Protein Immunodetection
| Nome: | Descrição: | Tamanho: | Formato: | |
|---|---|---|---|---|
| 2.65 MB | Adobe PDF |
Autores
Orientador(es)
Resumo(s)
Worldwide, TBI is estimated to affect 64-74 million individuals, or around 759 per every 100.000
people, mostly in developing countries, and is often called the “silent epidemic”, leading to
neurodegenerative diseases such as Alzheimer’s. Quick TBI diagnosis is of extreme importance
to assure the best chances for a full recovery, avoiding dangerous complications. Point-of-care
testing platforms (POTC) are needed in such cases, where most of these accidents occur and easy
access to the necessary diagnosis equipment is not common. Therefore, in this work, a method
for the ultrasensitive detection of Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) in blood, is explored, by
combining gold nanostars (AuNS) functionalized with 4-mercaptobenzoic acid with Surface
Enhanced Raman Spectroscopy (SERS), to enable quantification of the GFAP on a blood sample.
This thesis also explores the formation of gold nanosphere (AuNP) conjugates for the
colorimetric and qualitative analysis of GFAP. Due to the anti-GFAP antibody inducing
aggregation, anti-HRP was used to form both AuNP and AuNS conjugates for the detection of
HRP, and for further testing. This serves as a proof-of-concept and for optimisation with a model
antibody, optimising the loading concentration of both antibody and blocking protein (BSA) by
agarose gel electrophoresis (AGE), UV-Vis, Dynamic Light Scattering and enzymatic activity
assays. Sensitivity tests were made using anti-HRP and HRP, with a visual cutoff value of 180 ng
for the qualitative part. The cutoff value for the quantitative part of the assay, using SERS analysis,
was assessed to be around the same values, between 180 and 60 ng, by calculating the peak
integral of the 1589 cm-1 4-MBA peak. In the end, promising results were obtained, needing the
shift from the model antibody to the anti-GFAP antibody for accurate detection of TBI in blood.
Obtaining a quick, POCT diagnosis tool such as an LFA would help alleviate the burden of
hospitals in developed countries, avoid missed diagnosis and provide with an easy to use, cheap,
easily storable and easily shipped tool for developing countries where this issue is most prevalent
in the world, contributing to the decrease of this “silent epidemic”.
Em todo o mundo, estima-se que o traumatismo cranioencefálico (TCE) afete entre 64 a 74 milhões de indivíduos, ou cerca de 759 por cada 100.000 pessoas, maioritariamente em países em desenvolvimento, sendo frequentemente denominado a “epidemia silenciosa”, uma vez que pode levar a doenças neurodegenerativas como a doença de Alzheimer. Um diagnóstico rápido de TCE é de extrema importância para assegurar as melhores hipóteses de uma recuperação completa, evitando complicações perigosas. Plataformas de testes no ponto de cuidado (POCT) são necessárias nesses casos, onde a maioria destes acidentes ocorre e o acesso fácil ao equipamento de diagnóstico necessário não é comum. Assim, neste trabalho, é explorado um método para a deteção ultra-sensível da Proteína Glial Fibrilar Ácida (GFAP) no sangue, combinando nanoestrelas de ouro (AuNS) funcionalizadas com ácido 4-mercaptobenzoico com Espectroscopia Raman Intensificada por Superfície (SERS), para permitir a quantificação de GFAP numa amostra de sangue. Esta tese também explora a formação de conjugados de nanospheres de ouro (AuNP) para a análise colorimétrica e qualitativa de GFAP. Devido à indução de agregação pelo anticorpo anti-GFAP, foi utilizado o anticorpo anti-HRP para formar conjugados de AuNP e AuNS para a deteção de HRP. Isto serve como prova de conceito e para a optimização com um anticorpo modelo, optimizando a concentração de carga de ambos, o anticorpo e a proteína de bloqueio (BSA), através de eletroforese em gel de agarose (AGE), UV-Vis, Dispersão de Luz Dinâmica e ensaios de atividade enzimática. Foram realizados testes de sensibilidade usando anti-HRP e HRP, com um valor de corte visual entre 180 ng e 60 ng para a parte qualitativa. O valor de corte para a parte quantitativa do ensaio, usando a análise SERS, foi estabelecido dentro dos mesmos valores, entre 180 ng e 60 ng, através do cálculo do integral do pico de 1589 cm-1 do pico do 4-MBA. No final, foram obtidos resultados promissores, sendo necessário passar do anticorpo modelo para o anticorpo anti-GFAP para a deteção precisa de TCE no sangue. Obter uma ferramenta de diagnóstico rápido POCT, como um LFA, ajudaria a aliviar a sobrecarga nos hospitais dos países desenvolvidos, evitar diagnósticos falhados e fornecer uma ferramenta fácil de usar, barata, facilmente armazenável e facilmente transportável para os países em desenvolvimento, onde este problema é mais prevalente no mundo, contribuindo para a diminuição desta “epidemia silenciosa”.
Em todo o mundo, estima-se que o traumatismo cranioencefálico (TCE) afete entre 64 a 74 milhões de indivíduos, ou cerca de 759 por cada 100.000 pessoas, maioritariamente em países em desenvolvimento, sendo frequentemente denominado a “epidemia silenciosa”, uma vez que pode levar a doenças neurodegenerativas como a doença de Alzheimer. Um diagnóstico rápido de TCE é de extrema importância para assegurar as melhores hipóteses de uma recuperação completa, evitando complicações perigosas. Plataformas de testes no ponto de cuidado (POCT) são necessárias nesses casos, onde a maioria destes acidentes ocorre e o acesso fácil ao equipamento de diagnóstico necessário não é comum. Assim, neste trabalho, é explorado um método para a deteção ultra-sensível da Proteína Glial Fibrilar Ácida (GFAP) no sangue, combinando nanoestrelas de ouro (AuNS) funcionalizadas com ácido 4-mercaptobenzoico com Espectroscopia Raman Intensificada por Superfície (SERS), para permitir a quantificação de GFAP numa amostra de sangue. Esta tese também explora a formação de conjugados de nanospheres de ouro (AuNP) para a análise colorimétrica e qualitativa de GFAP. Devido à indução de agregação pelo anticorpo anti-GFAP, foi utilizado o anticorpo anti-HRP para formar conjugados de AuNP e AuNS para a deteção de HRP. Isto serve como prova de conceito e para a optimização com um anticorpo modelo, optimizando a concentração de carga de ambos, o anticorpo e a proteína de bloqueio (BSA), através de eletroforese em gel de agarose (AGE), UV-Vis, Dispersão de Luz Dinâmica e ensaios de atividade enzimática. Foram realizados testes de sensibilidade usando anti-HRP e HRP, com um valor de corte visual entre 180 ng e 60 ng para a parte qualitativa. O valor de corte para a parte quantitativa do ensaio, usando a análise SERS, foi estabelecido dentro dos mesmos valores, entre 180 ng e 60 ng, através do cálculo do integral do pico de 1589 cm-1 do pico do 4-MBA. No final, foram obtidos resultados promissores, sendo necessário passar do anticorpo modelo para o anticorpo anti-GFAP para a deteção precisa de TCE no sangue. Obter uma ferramenta de diagnóstico rápido POCT, como um LFA, ajudaria a aliviar a sobrecarga nos hospitais dos países desenvolvidos, evitar diagnósticos falhados e fornecer uma ferramenta fácil de usar, barata, facilmente armazenável e facilmente transportável para os países em desenvolvimento, onde este problema é mais prevalente no mundo, contribuindo para a diminuição desta “epidemia silenciosa”.
Descrição
Palavras-chave
Traumatic brain Injury Glial Fibrillary Acidic Protein Lateral flow assay Surface enhanced Raman scattering Gold nanostars Gold nanoparticles