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Publicação
Glia in intercellular communication at the drosophila neuromuscular junction
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Resumo(s)
Neuromuscular junctions (NMJs) are highly efficient synapses that despite being maintained throughout life, undergo both functional and structural remodelling. From Drosophila to mammals, glial cells invade the NMJ and interact with neurons, having roles in growth, maintenance and function. Peripheral nerves in Drosophila larvae are enwrapped by three glial subtypes, wrapping glia (WG), subperineurial glia (SPG) and perineurial glia (PG), and the two outermost layers (SPG and PG) are known to extend processes towards the nerve terminal, including synaptic boutons. Glia, together with muscle cells, clear cellular debris and immature boutons, formed following high neuronal activity, via the engulfment receptor Draper (MEGF10 in Mammalia). SPG are thought to induce bouton growth via glia-muscle Maverick (of the TGF-β, transforming growth factor β, family) signalling. PG contact synapses and grow along the nerve terminal, possibly in an activity-dependent fashion, but no functions other than blood-nerve barrier formation in adult flies have been identified. In adult NMJs, perisynaptic glia have functions such as glutamate recycling and trachea (the fly’s oxygen distribution vessels) coupling to neurons. Despite these efforts to uncover glial function at the NMJ, questions remain such as: does each glial subtype have a specialized function? Is trachea-neuron coupling in larval NMJs performed by peripheral glia? Can glia regulate synaptic function, including plasticity, in response to activity?
We aimed to characterize intercellular interactions at the NMJ, in particular glial structure, dynamism and function at the 3rd instar Drosophila larval NMJ. To do this, we took advantage of Drosophila genetics and time-lapse live imaging following acute induction of synaptic structural plasticity. Live imaging revealed that SPG processes are dynamic and contact boutons during activity-driven bouton formation, being able to contract around mature boutons to promote budding of new pre-synaptic structures. PG are also dynamic and contact axonal branches and synaptic boutons. Co-labelling of PG and tracheal cells followed by 3D reconstruction revealed physical interactions between these 3 cell types, possibly reflecting a novel function of PG as mediators of neuron-trachea coupling. Tracheal cells also dynamically extend and retract and contact synaptic boutons, sometimes during bouton formation events, where trachea seem to guide the newly-formed bouton. Genetic ablation of WG, but not SPG, led to the accumulation of neuronal debris. As WG do not extend into the NMJ, we want to explore how WG contribute to debris clearance. Ablating SPG appears to affect the frequency of bouton formation.
Our data suggests that local signalling events take place in the contacts between glial, neuronal and tracheal processes. Our findings support the notion of specialized glial functions at the NMJ. Also, glial and/or tracheal presence may help determine the site of synaptic bouton formation. Finally, this work unravels an in vivo interplay between motor neurons, glia, muscle and trachea, highlighting the importance of intercellular communication for NMJ development and function. As non-neuronal cells are increasingly recognized as regulators of neuronal function, it becomes clear that understanding how these different cell types interact will shed light onto the mechanisms that govern nervous system function and dysfunction, hopefully leading to new therapeutic approaches.
As junções neuromusculares são sinapses altamente eficazes que, embora muitas vezes persistam durante toda a vida de um animal, exibem plasticidade, sofrendo mudanças funcionais e estruturais em resposta às necessidades de inervação do músculo. Desde invertebrados como a mosca da fruta, até humanos, células da glia invadem a junção neuromuscular e interagem com músculos e neurónios, regulando o desenvolvimento e função das sinapses. Os axónios periféricos em Drosophila são isolados do meio exterior por três camadas gliais: as wrapping glia (WG) contactam directamente os axónios enquanto as subperineurial glia (SPG) e as perineurial glia (PG) estabelecem a barreira hematoencefálica e interagem com os terminais pré-sinápticos. Juntamente com as células musculares, as células da glia fagocitam fragmentos de membrana neuronal e botões sinápticos recém-formados após actividade neuronal intensa e não destinados a maturar, através do receptor Draper, conservado entre mamíferos (MEGF10) e Drosophila. As SPG participam na sinaptogénese libertando Maverick, uma proteína da família TGF-β, que actua no músculo, levando a que este promova a formação de novos botões sinápticos. O desenvolvimento das PG é influenciado pelo crescimento neuronal e pensa-se que possam ser sensíveis a actividade sináptica, mas pouco se sabe sobre este subtipo glial. Em moscas adultas, um quarto subtipo glial, as perisynaptic glia, faz reciclagem de glutamato e interage simultaneamente com neurónios e com as traqueias, o sistema de distribuição de oxigénio em Drosophila. Apesar destes esforços para caracterizar o papel desempenhado pelas células da glia em junções neuromusculares, muitas questões permanecem por responder: cada subtipo é especializado em determinadas funções? Existem funções partilhadas? Como são estabelecidas as interacções entre neurónios e traqueias em larvas de Drosophila? São as células da glia capazes de regular funções e plasticidade sinápticas? O objectivo deste estudo é caracterizar as interacções entre os diversos tipos celulares em junções neuromusculares larvares, com vista à identificação de funções gliais. Tirámos proveito de ferramentas genéticas em Drosophila, juntamente com microscopia confocal de fluorescência em tempo real e de protocolos de estimulação neuronal que induzem plasticidade sináptica estrutural para analisar a morfologia e dinâmica dos diferentes tipos celulares in vivo. Os nossos resultados indicam que as SPG contactam botões sinápticos através de protusões membranares dinâmicas e participam na formação de novos botões através de um mecanismo de contracção que promove a formação de estruturas pré-sinápticas e, possivelmente, sinalização local. A análise morfológica das PG revelou que são dinâmicas e contactam os neurónios, o músculo e as traqueias. Reconstruções 3D demonstram que protusões membranares das PG se colocam entre as traqueias e os botões, por vezes também os envolvendo e provavelmente reflectindo uma nova função das PG – mediar as interacções, incluindo trocas gasosas, entre botões sinápticos e traqueias. As células que compõem as traqueias também são dinâmicas, constantemente explorando o ambiente extracelular através de finas extensões membranares. Estas contactam frequentemente botões, por vezes durante a génese e crescimento de novos botões, guiando-os. De modo a identificar novas funções gliais, eliminámos selectivamente cada subtipo e analisámos a morfologia neuronal e plasticidade sináptica estrutural. Quando na ausência de WG, mas não de SPG, fragmentos de membrana neuronal acumulam-se junto ao terminal axonal, e quando as SPG foram eliminadas a capacidade de formação de novos botões foi afectada. Em suma, este trabalho revelou diversas interacções intercelulares in vivo em junções neuromusculares de Drosophila, onde diferentes subtipos gliais têm funções como promover o crescimento neuronal e mediar o contacto com as traqueias, assegurando o fornecimento de oxigénio. Perceber como as células não neuronais participam no desenvolvimento e funções neuronais permitirá uma melhor compreensão do sistema nervoso e possivelmente a criação de novas terapias que tenham como alvo estes mecanismos intercelulares.
As junções neuromusculares são sinapses altamente eficazes que, embora muitas vezes persistam durante toda a vida de um animal, exibem plasticidade, sofrendo mudanças funcionais e estruturais em resposta às necessidades de inervação do músculo. Desde invertebrados como a mosca da fruta, até humanos, células da glia invadem a junção neuromuscular e interagem com músculos e neurónios, regulando o desenvolvimento e função das sinapses. Os axónios periféricos em Drosophila são isolados do meio exterior por três camadas gliais: as wrapping glia (WG) contactam directamente os axónios enquanto as subperineurial glia (SPG) e as perineurial glia (PG) estabelecem a barreira hematoencefálica e interagem com os terminais pré-sinápticos. Juntamente com as células musculares, as células da glia fagocitam fragmentos de membrana neuronal e botões sinápticos recém-formados após actividade neuronal intensa e não destinados a maturar, através do receptor Draper, conservado entre mamíferos (MEGF10) e Drosophila. As SPG participam na sinaptogénese libertando Maverick, uma proteína da família TGF-β, que actua no músculo, levando a que este promova a formação de novos botões sinápticos. O desenvolvimento das PG é influenciado pelo crescimento neuronal e pensa-se que possam ser sensíveis a actividade sináptica, mas pouco se sabe sobre este subtipo glial. Em moscas adultas, um quarto subtipo glial, as perisynaptic glia, faz reciclagem de glutamato e interage simultaneamente com neurónios e com as traqueias, o sistema de distribuição de oxigénio em Drosophila. Apesar destes esforços para caracterizar o papel desempenhado pelas células da glia em junções neuromusculares, muitas questões permanecem por responder: cada subtipo é especializado em determinadas funções? Existem funções partilhadas? Como são estabelecidas as interacções entre neurónios e traqueias em larvas de Drosophila? São as células da glia capazes de regular funções e plasticidade sinápticas? O objectivo deste estudo é caracterizar as interacções entre os diversos tipos celulares em junções neuromusculares larvares, com vista à identificação de funções gliais. Tirámos proveito de ferramentas genéticas em Drosophila, juntamente com microscopia confocal de fluorescência em tempo real e de protocolos de estimulação neuronal que induzem plasticidade sináptica estrutural para analisar a morfologia e dinâmica dos diferentes tipos celulares in vivo. Os nossos resultados indicam que as SPG contactam botões sinápticos através de protusões membranares dinâmicas e participam na formação de novos botões através de um mecanismo de contracção que promove a formação de estruturas pré-sinápticas e, possivelmente, sinalização local. A análise morfológica das PG revelou que são dinâmicas e contactam os neurónios, o músculo e as traqueias. Reconstruções 3D demonstram que protusões membranares das PG se colocam entre as traqueias e os botões, por vezes também os envolvendo e provavelmente reflectindo uma nova função das PG – mediar as interacções, incluindo trocas gasosas, entre botões sinápticos e traqueias. As células que compõem as traqueias também são dinâmicas, constantemente explorando o ambiente extracelular através de finas extensões membranares. Estas contactam frequentemente botões, por vezes durante a génese e crescimento de novos botões, guiando-os. De modo a identificar novas funções gliais, eliminámos selectivamente cada subtipo e analisámos a morfologia neuronal e plasticidade sináptica estrutural. Quando na ausência de WG, mas não de SPG, fragmentos de membrana neuronal acumulam-se junto ao terminal axonal, e quando as SPG foram eliminadas a capacidade de formação de novos botões foi afectada. Em suma, este trabalho revelou diversas interacções intercelulares in vivo em junções neuromusculares de Drosophila, onde diferentes subtipos gliais têm funções como promover o crescimento neuronal e mediar o contacto com as traqueias, assegurando o fornecimento de oxigénio. Perceber como as células não neuronais participam no desenvolvimento e funções neuronais permitirá uma melhor compreensão do sistema nervoso e possivelmente a criação de novas terapias que tenham como alvo estes mecanismos intercelulares.
Descrição
Palavras-chave
Drosophila