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Publicação
Optimization of techniques for rapid assessment of inflammatory responses
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Resumo(s)
Inflammation is a defence mechanism involving the immune system, inresponse to infection or other types of cell damage. In acute inflammation,immunecells migrate to the injury site, become activated and express pro-inflammatory cytokinesto rapidly eliminate the pathogenic factors. Chronic inflammation may be preceded by the persistence of acute inflammation and involves mononuclear invasion that causes tissue damage orrepair. Chronic inflammation is now thought to be aprocess underlying a significant percentage of disease-related deaths worldwide. Therefore, it is importanttodevelop methods to identify inflammationof patients in the least invasive way. The current work aims to optimise a protocol to investigateinflammation biomarkers in patients suffering from chronic diseases. We hypothesised that these biomarkerscould be addressed by analysing patients blood samplesor fibroblast stimulated with mitogen orpro-inflammatory cytokines. To optimise the stimulation protocol, we tested different concentrations of PMA with Ionomycin, TNFαand lipopolysaccharide(LPS)to obtain effective cellular stimulation in the shortest time possible, preserving cell viability. For the blood sample,we evaluated cell surface biomarkers, CD69and CD154and the expression of the pro-inflammatory cytokineIFNγbyflow cytometrywhile for fibroblasts we analysed the expression of IL-6 and FGF-2 by RT-qPCR.Our results showedthat the ideal concentration of stimulus used for evaluation of whole blood samples is 50 ng/ml of PMA +1μg/ml of ionomycin for cytokine evaluation and 5,5 ng/ml of PMA +0,05 μg/ml of ionomycinfor cell surface markersevaluation.Moreover, the optimal concentration for dermal fibroblastsstimulationis100 ng/ml of TNFα, 25 ng/mlofPMA+ 3 μg/ml ionomycin and 1 μg/ml of LPS.We were able to observe the expression of all biomarkers tested and their modulation upon stimulation.This work helps to demonstrate that a rapid protocol can be used to evaluate inflammatory biomarkers in blood samples and that fibroblast can be a reliable alternative to evaluate inflammatory stimulation. These protocols are essential to screenfor inflammation biomarkers in diseases suchasosteoarthritis, cancer, asthma, among others.
A inflamação é um mecanismo de defesa que envolve o sistema imunitário, em resposta à infeção ou a outros tipos de danos celulares. Na inflamação aguda, as células imunes migram para o local da lesão, tornam-se ativadas, expressam citocinas pró-inflamatórias para eliminar rapidamente os fatores patogénicos. A inflamação crónica pode ser precedida pela persistência da inflamação aguda e envolve a invasão mononuclear que causa dano ou reparo do tecido. A inflamação crónica é atualmente considerada um processo subjacente a uma percentagem significativa de mortes relacionadas a doenças em todo o mundo. Por conseguinte, é importante desenvolver métodos para identificar a inflamação nos pacientes da forma menos invasiva.O presente trabalho tem como objetivo otimizar um protocolo para investigar biomarcadores de inflamação em pacientes portadores de doenças crónicas. A nossa hipótese recaiu sobrese osbiomarcadores utilizados poderiam ser direcionados para a análise de amostras de sangue de doentes ou fibroblastos estimulados com mitogénio ou citocínas pró-inflamatórias.Para otimizar o protocolo de estimulação, testamos diferentes concentrações de PMA com Ionomicina, TNFα e lipopolisacárido (LPS)para obter uma estimulação celular eficaz no menor tempo possível, preservando a viabilidade celular. Para a amostra de sangue, avaliamos biomarcadores de superfície celular, CD69 e CD154 e a expressão da citocina pró-inflamatória IFNγpor citometria de fluxo, enquanto para fibroblastos analisámos a expressão de IL-6 e FGF-2 por RT-qPCR.Os resultados mostraram que a concentração ideal de estímulo utilizada para avaliação de amostras de sangue total é de 50 ng/ml de PMA + 1 μg/ml de ionomicina para avaliação de citocinas e 5,5 ng/ml de PMA + 0,05 μg/ml de ionomicina para avaliação demarcadores celulares de superfície. Além disso, a concentração ideal para estimulação de fibroblastos dérmicos é de 100 ng/ml de TNFα, 25 ng/ml de PMA + 3 μg/ml de ionomicina e 1 μg/ml de LPS. Conseguimos observar a expressão de todos os biomarcadores testados e a sua modulação após estimulação.Este trabalho ajuda a demonstrar que um protocolo rápido pode ser usado para avaliar biomarcadores inflamatórios em amostras de sangue e que os fibroblastos podem ser uma alternativa confiável para avaliar a estimulação inflamatória. Estes protocolos são essenciais para rastrear biomarcadores de inflamação em doenças, como osteoartrite, cancro, asma, entre outras.
A inflamação é um mecanismo de defesa que envolve o sistema imunitário, em resposta à infeção ou a outros tipos de danos celulares. Na inflamação aguda, as células imunes migram para o local da lesão, tornam-se ativadas, expressam citocinas pró-inflamatórias para eliminar rapidamente os fatores patogénicos. A inflamação crónica pode ser precedida pela persistência da inflamação aguda e envolve a invasão mononuclear que causa dano ou reparo do tecido. A inflamação crónica é atualmente considerada um processo subjacente a uma percentagem significativa de mortes relacionadas a doenças em todo o mundo. Por conseguinte, é importante desenvolver métodos para identificar a inflamação nos pacientes da forma menos invasiva.O presente trabalho tem como objetivo otimizar um protocolo para investigar biomarcadores de inflamação em pacientes portadores de doenças crónicas. A nossa hipótese recaiu sobrese osbiomarcadores utilizados poderiam ser direcionados para a análise de amostras de sangue de doentes ou fibroblastos estimulados com mitogénio ou citocínas pró-inflamatórias.Para otimizar o protocolo de estimulação, testamos diferentes concentrações de PMA com Ionomicina, TNFα e lipopolisacárido (LPS)para obter uma estimulação celular eficaz no menor tempo possível, preservando a viabilidade celular. Para a amostra de sangue, avaliamos biomarcadores de superfície celular, CD69 e CD154 e a expressão da citocina pró-inflamatória IFNγpor citometria de fluxo, enquanto para fibroblastos analisámos a expressão de IL-6 e FGF-2 por RT-qPCR.Os resultados mostraram que a concentração ideal de estímulo utilizada para avaliação de amostras de sangue total é de 50 ng/ml de PMA + 1 μg/ml de ionomicina para avaliação de citocinas e 5,5 ng/ml de PMA + 0,05 μg/ml de ionomicina para avaliação demarcadores celulares de superfície. Além disso, a concentração ideal para estimulação de fibroblastos dérmicos é de 100 ng/ml de TNFα, 25 ng/ml de PMA + 3 μg/ml de ionomicina e 1 μg/ml de LPS. Conseguimos observar a expressão de todos os biomarcadores testados e a sua modulação após estimulação.Este trabalho ajuda a demonstrar que um protocolo rápido pode ser usado para avaliar biomarcadores inflamatórios em amostras de sangue e que os fibroblastos podem ser uma alternativa confiável para avaliar a estimulação inflamatória. Estes protocolos são essenciais para rastrear biomarcadores de inflamação em doenças, como osteoartrite, cancro, asma, entre outras.
Descrição
Palavras-chave
Flow cytometry Immune cells Chronic inflammation Fibroblasts Biomarkers