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The important role of circular dorsal ruffles in the internalization and trafficking of the insulin receptor
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Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is one of the most common chronic diseases worldwide, mainly caused by excessive body weight and a sedentary lifestyle. This disorder is increasing exponentially, affecting 425 million people, a number expected to increase up to 692 million by 2045. Although the pathogenesis of T2DM has been thoroughly studied, the available treatment options are still scarce. Insulin resistance is a hallmark for T2DM and occurs when the body cannot respond appropriately to circulating insulin levels. It is characterized by hyperinsulinemia, hyperglycemia and hypertriglyceridemia. Importantly, insulin resistance (IR) is not limited to the liver and skeletal muscle, also affecting organs like the adipose tissue, heart, kidney and brain. Thus, diabetes is viewed nowadays as a complex disorder affecting multiple organ systems. Subclinical chronic inflammation appears to be the common denominator between IR and T2DM, although the molecular mechanisms underlying this connection are still controversial.
The liver is a central metabolic organ in regulating whole-body homeostasis and energy metabolism. It helps maintaining fasting glucose levels through gluconeogenesis, as in the fed state converts glucose into glycogen and lipids for storage. Insulin has a central role in controlling hepatic energy metabolism, suppressing glucose production while stimulating lipogenesis.
At a cellular level, the molecular mechanism underlying the onset of IR is the impairment of the insulin signaling pathway in hepatocytes, myocytes and adipocytes among others. The insulin signaling cascade is a complex and broad pathway that at each step contains several molecules or isoforms capable of transducing the signal, each with distinct but overlapping functions. Besides its main target pathway, insulin also activates a number of downstream cascades that intertwine and modulate each other. Impairing the activity of any single component, from insulin binding to the molecules involved in insulin receptor (InsR) internalization and trafficking and signal propagation, can lead to IR.
Cells undergo active remodeling in response to a variety of physiological and pathological stimuli. Importantly, circular dorsal ruffle (CDR) formation emerged as an important type of membrane reorganization involved in RTK internalization. CDR-mediated macropinocytosis is a selective process, as only ligand-bound receptors are internalized. This is a widespread endocytic route, as these structures form in a variety of cell types upon stimulation with different growth factors, strongly supporting their relevance. InsR internalization is a crucial step for insulin signaling pathway activation, insulin metabolism and receptor downregulation at the plasma membrane, avoiding deleterious effects of an overactive pathway. Moreover, InsR internalization is especially important in the liver, since it determines peripheral insulin bioavailability, through the balance between insulin secretion and clearance, hence maintaining glucose homeostasis in the target organs.
Although several studies show clathrin-mediated endocytosis as the main pathway for InsR internalization, these studies are quite vague and do not focus on the relevance of receptor recycling and/or degradation, and on how this pathways may be altered in IR. Knowing that CDR-mediated internalization is able to remove large amounts of activated receptors from the plasma membrane, we hypothesized that CDRs are a non-canonical endocytic pathway involved in the internalization and recycling/degradation of the InsR.
The overall goal of this work was to understand the role for CDR-mediated macropinocytosis in InsR internalization, in physiological and pathophysiological contexts. The specific aims were to determine whether insulin promotes CDR formation in these cells; to understand if the InsR is sequestered and internalized through CDR-mediated macropinocytosis upon insulin stimulation; to study the role of CDR formation in hepatocytes; and finally, to explore the impact of chronic high insulin levels and iNOS overexpression in insulin-mediated CDR formation.
For the first aim of this study, we used Hepa 1-6 mouse hepatoma cells stimulated with increasing insulin concentrations, to assess CDR formation. We demonstrate for the first time that insulin treatment stimulates CDR formation in hepatocytes, as early as one minute after insulin addition to the media, in a time- and concentration-dependent manner. CDR formation reaches a peak 5 minutes after stimulation, returning to close to basal levels at 60 minutes after treatment. The same pattern was observed upon intermediate and low insulin concentrations, although the increase was not as striking. Signaling events mediated by ligand binding to RTKs are a very fast process, which we confirmed by analyzing insulin signaling pathway activation through InsR and Akt phosphorylation. As expected, in the absence of an insulin stimulus, mimicking a fasting state, InsR and Akt are not phosphorylated; on the other hand, in a postprandial state scenario as insulin levels increase, both receptor and Akt become phosphorylated as early as one minute after insulin treatment, concomitant with CDR formation. We also evaluated the formation of CDRs in mouse primary hepatocytes, which are more representative of the liver physiology. We confirmed that insulin also stimulates CDR formation in these cells. The remarkable increase in CDR formation after insulin stimulation led us to our next aim. The finding that endogenous InsR localizes to CDRs upon insulin stimulation, demonstrated by immunofluorescence, strongly suggests that InsR internalization is mediated by these structures. The InsR is mostly located at the plasma membrane when insulin is absent, being sequestered to CDRs upon insulin treatment. The presence of the receptor in these structures starts decreasing at 30 minutes, being completely internalized 60 minutes after stimulation. Live-imaging corroborates these findings, as we were able to observe the formation of CDRs at the dorsal surface of InsR-GFP transfected cells and the localization of InsR to the structures.
Next, we investigated the impact of WAVE1 silencing, a protein involved in CDR ring formation, in insulin signaling. We confirmed by immunofluorescence that WAVE1 silencing robustly decreases insulin-stimulated CDR formation, and also decreases Akt Ser473 and Thr398 phosphorylation, indicating an impairment in insulin signaling.
We finally addressed the consequence of chronic high insulin exposure and iNOS overexpression a characteristic of sub-clinical inflammation in CDR formation and insulin signaling. In cells incubated in conditions mimicking hyperinsulinemia for 48 hours, we observed a decrease in CDR formation. Aa curious aspect is that this decrease is drastic in cells that were serum-starved without insulin in the media, as in cells where insulin was always present. Finally, increased NO concentrations also abrogate CDR formation, further impairing insulin signaling by decreasing phosphorylated levels of InsR and Akt phosphorylation.
We propose that CDR-mediated InsR endocytosis works alongside other endocytic pathways, mediating receptor internalization. We showed that CDR formation is a common pathway present in insulin-sensitive tissues and that its abrogation impairs insulin signaling activation. Furthermore, pathophysiological conditions such as hyperinsulinemia and sub-clinical inflammation dramatically abrogate CDR formation. Endocytosis through CDRs might allow the cells to rapidly recycle the InsR back to the plasma membrane or to downregulate signal, as this pathway internalizes large amounts of activated receptors. Further studies are necessary to better understand this mechanism and its influence on InsR recycling/degradation.
A diabetes tipo 2 (DT2) é uma das doenças crónicas mais prevalentes a nível mundial, sendo causada maioritariamente por excesso de peso, provocado por um estilo de vida sedentário. Esta doença tem vindo a aumentar exponencialmente, afetando 425 milhões de pessoas, um número que se espera vir a aumentar para 692 milhões em 2045. Apesar da patogénese da DT2 ser um assunto minuciosamente estudado, as opções de tratamento são ainda escassas. A resistência à insulina é uma das características fundamentais em Prediabetes/DT2, e ocorre quando o organismo não consegue respondes de modo apropriado aos níveis de insulina em circulação. A resistência a insulina é caracterizada por hiperinsulinemia, hiperglicemia e hipertrigliceridemia. A reter, este estado não é limitado a um único órgão, seja ele o fígado ou o musculo esquelético, afetando todo o organismo. Assim, a diabetes é percebida hoje em dia como uma doença complexa que atua de forma sistémica. Outra característica que liga a resistência à insulina e a DT2 é a inflamação crónica subclínica, no entanto não se conhecem exatamente os mecanismos envolvidos nesta ligação. O fígado é o mais importante órgão a nível metabólico, regulando a homeostasia corporal e o metabolismo da energia. Em jejum, o fígado ajuda à manutenção dos níveis de glucose através da gliconeogénese, enquanto no pós-prandial, converte glucose em glicogénio e lípidos para armazenamento. A insulin tem um papel central nesta dinâmica, controlado o metabolismo energético no fígado através da supressão da produção endógena de glucose e estimulando a lipogénese. A nível celular, o mecanismo molecular subjacente ao inicio da resistência a insulina é a diminuição da ativação da via de sinalização da insulina em hepatócitos, miócitos e adipócitos. A cascata de sinalização da insulina é um mecanismo complexo que a cada passo envolve várias moléculas capazes de transdução de sinal, cada uma com as suas respetivas funções, que se acabam por sobrepor. Alem da sua via preferencial, a insulin ativa várias outras cascatas que interligam e modulam. A diminuição da atividade de qualquer um destes componentes ou em qualquer um destes passos, desde a ligação da insulina ao seu recetor, internalização e trafego do complexo, e propagação de sinal podem levar ao desenvolvimento de resistência a insulina. As células experimentar remodelação ativa em resposta a variados estímulos quer fisiológicos quer fisiopatológicos. A formação de circular dorsal rufles (CDRs) é um importante tipo de reorganização membranar, envolvida na internalização de recetores tirosina cinase. A macropinocitose mediada por CDRs é um processo seletivo que apenas internaliza recetores ligados ao seu ligando. Esta via endocítica está bastante difundida, já que as CDRs se formam nos mais variados tecidos após estimulação por fatores de crescimento, o que mostra a sua relevância. A internalização do recetor da insulina é um passo fundamental para a ativação da via de sinalização da insulina, para a metabolização da insulina e para a diminuição do sinal na membrana plasmática, ao remover os recetores da superfície, evitando efeitos deletérios de uma sobre-ativação da via. Para mais, a internalização do recetor é particularmente importante no fígado, já que determina os níveis periféricos de insulina, ao ser responsável pelo balanço entre a insulina secretada e a que sofre clearance, mantendo a homeostasia da glucose na periferia. Apesar dos vários estudos que apontam a endocitose mediada por clatrina como a via mais importante na internalização do recetor da insulina, esses estudos são bastante vagos e não mostram a importância da reciclagem e/ou degradação do recetor, e como estas vias podem estar alteradas na resistência a insulina. Sabendo ainda que a internalização mediada por CDRs é responsável em grande parte for diminuir a sinalização na membrana ao remover grandes quantidades de recetores ativos da superfície, neste trabalho propusemos que a internalização mediada por CDRs é uma via endocítica não canónica, envolvida na internalização e reciclagem/degradação do recetor da insulina. O objetivo principal deste trabalho é perceber o papel das CDRs na internalização do recetor da insulin, em contextos fisiológicos e fisiopatológicos. Especificamente, queríamos determinar se a insulina estimula a formação de CDRs em hepatócitos e células do musculo esquelético, se o recetor é sequestrado e internalizado através destas estruturas após estimulação com insulina, perceber o papel das CDRs nestas células, e finalmente explorar o impacto de elevados níveis de insulina e da sobre expressão da iNOS na formação de CDRs. Para responder à nossa primeira pergunta, utilizamos células Hepa 1-6 de hepatoma de murganho, para demonstrar a formação de CDRs. Neste trabalho, mostramos pela primeira que a estimulação com insulina promove a formação de CDRs nestas células, imediatamente 1 minuto após adição da insulina ao meio. A formação de CDRs é dependente do tempo de estimulação e da concentração de insulina. O pico no número de células a formar CDRs éatingido aos 5 minutos de estimulação, diminuindo para níveis basais aos 60 minutos. O mesmo padrão é observado para concentrações mais baixas de insulina, no entanto o aumento não é tão notável. A ativação das vias de sinalização por ligação de fatores de crescimento a recetores tirosina cinese é um processo extremamente rápido, o que confirmamos pela análise da ativação da via de sinalização da insulina através da fosforilação do recetor da insulina e do seu target, Akt. Como esperado, na ausência de um estímulo de insulina, mimetizando o estado de jejum, tanto o Receptor como o Akt não estão fosforilados. No entanto, num cenário de pós-prandial, com o aumento da concentração de insulina, ambos ficam fosforilados, logo após 1 minuto de estimulação. Avaliamos ainda a formação de CDRs em hepatócitos primários de murganho, células mais representativas da fisiologia do fígado. Confirmamos que a insulina também promove a formação de CDRs nestas células. O extraordinário aumento na formação de CDRs após estimulação com insulina conduziu-nos ao nosso objetivo seguinte. Após estimulação com insulina, o recetor encontra-se localizado nestas estruturas, o que demonstramos por imunofluorescência, pela co-localização com a actina o que sugere fortemente que a internalização do recetor da insulina é mediada por estas estruturas. O recetor encontra-se maioritariamente localizado na membrana plasmática, quando não existe insulina no meio, sendo sequestrado em CDRs após adição da hormona. A presença do recetor nestas estruturas começa a diminuir 30 minutos após estímulo, tendo sido completamente internalizado aos 60 minutos. Observação de células in vivo confirma estes resultados, já que também observamos a formação de CDRs na superfície dorsal das células estimuladas com insulina e transfectadas com InsR-GFP, confirmando a localização do recetor nestas estruturas. A seguir, investigamos o impacto do silenciamento do WAVE1, uma proteína fundamental na formação de CDRs, na via de sinalização da insulina. Confirmamos por imunofluorescência que o silenciamento do WAVE1 diminuiu fortemente a formação de CDRs estimulada pela insulina e diminuiu a fosforilação do Akt nos seus dois resíduos (Ser473, Thr308), o que indica uma inibição da via de ativação da insulina. Quisemos ainda perceber quais as consequências da exposição crónicas a elevadas concentrações de insulina e da sobreexpressão de iNOS, uma característica da inflamação, na formação de CDRs. Em células incubadas em meio que mimetiza condições de hiperinsulinemia, durante 48 horas, observamos uma diminuição drástica na formação de CDRs. Curioso perceber que esta diminuição acontece tanto em células que estiveram em jejum na ausência de insulina, permitindo-lhes recuperar, como em células onde a insulina esteve sempre presente no meio de cultura. Também a sobreexpressão de iNOS, mimetizando inflamação, provocou uma diminuição da formação de CDRs, assim como nos níveis totais e na fosforilação de recetor de insulina, e na fosforilação do Akt. Com este trabalho propomos que a endocitose do recetor da insulina mediada por CDRs funciona em paralelo com outros mecanismo, mediando a internalização do recetor. Mostramos que a formação de CDRs estimulada por insulina é um mecanismo comum a órgãos alvo da insulina, e que impedindo a sua formação, há uma diminuição na ativação da via da insulina. Além do mais, condições que mimetizam fisiopatologia, como hiperinsulinemia e inflamação subclínica, diminuem de forma dramática a formação de CDRs. A endocitose do recetor por esta via pode permitir às células reciclarem rapidamente o recetor de volta à superfície, ou permitir uma rápida diminuição do sinal, já que este mecanismo permite a internalização de grandes quantidades de recetores ativados na célula. Futuramente, pretendemos perceber como é que as CDRs influenciam a reciclagem/degradação do recetor da insulina.
A diabetes tipo 2 (DT2) é uma das doenças crónicas mais prevalentes a nível mundial, sendo causada maioritariamente por excesso de peso, provocado por um estilo de vida sedentário. Esta doença tem vindo a aumentar exponencialmente, afetando 425 milhões de pessoas, um número que se espera vir a aumentar para 692 milhões em 2045. Apesar da patogénese da DT2 ser um assunto minuciosamente estudado, as opções de tratamento são ainda escassas. A resistência à insulina é uma das características fundamentais em Prediabetes/DT2, e ocorre quando o organismo não consegue respondes de modo apropriado aos níveis de insulina em circulação. A resistência a insulina é caracterizada por hiperinsulinemia, hiperglicemia e hipertrigliceridemia. A reter, este estado não é limitado a um único órgão, seja ele o fígado ou o musculo esquelético, afetando todo o organismo. Assim, a diabetes é percebida hoje em dia como uma doença complexa que atua de forma sistémica. Outra característica que liga a resistência à insulina e a DT2 é a inflamação crónica subclínica, no entanto não se conhecem exatamente os mecanismos envolvidos nesta ligação. O fígado é o mais importante órgão a nível metabólico, regulando a homeostasia corporal e o metabolismo da energia. Em jejum, o fígado ajuda à manutenção dos níveis de glucose através da gliconeogénese, enquanto no pós-prandial, converte glucose em glicogénio e lípidos para armazenamento. A insulin tem um papel central nesta dinâmica, controlado o metabolismo energético no fígado através da supressão da produção endógena de glucose e estimulando a lipogénese. A nível celular, o mecanismo molecular subjacente ao inicio da resistência a insulina é a diminuição da ativação da via de sinalização da insulina em hepatócitos, miócitos e adipócitos. A cascata de sinalização da insulina é um mecanismo complexo que a cada passo envolve várias moléculas capazes de transdução de sinal, cada uma com as suas respetivas funções, que se acabam por sobrepor. Alem da sua via preferencial, a insulin ativa várias outras cascatas que interligam e modulam. A diminuição da atividade de qualquer um destes componentes ou em qualquer um destes passos, desde a ligação da insulina ao seu recetor, internalização e trafego do complexo, e propagação de sinal podem levar ao desenvolvimento de resistência a insulina. As células experimentar remodelação ativa em resposta a variados estímulos quer fisiológicos quer fisiopatológicos. A formação de circular dorsal rufles (CDRs) é um importante tipo de reorganização membranar, envolvida na internalização de recetores tirosina cinase. A macropinocitose mediada por CDRs é um processo seletivo que apenas internaliza recetores ligados ao seu ligando. Esta via endocítica está bastante difundida, já que as CDRs se formam nos mais variados tecidos após estimulação por fatores de crescimento, o que mostra a sua relevância. A internalização do recetor da insulina é um passo fundamental para a ativação da via de sinalização da insulina, para a metabolização da insulina e para a diminuição do sinal na membrana plasmática, ao remover os recetores da superfície, evitando efeitos deletérios de uma sobre-ativação da via. Para mais, a internalização do recetor é particularmente importante no fígado, já que determina os níveis periféricos de insulina, ao ser responsável pelo balanço entre a insulina secretada e a que sofre clearance, mantendo a homeostasia da glucose na periferia. Apesar dos vários estudos que apontam a endocitose mediada por clatrina como a via mais importante na internalização do recetor da insulina, esses estudos são bastante vagos e não mostram a importância da reciclagem e/ou degradação do recetor, e como estas vias podem estar alteradas na resistência a insulina. Sabendo ainda que a internalização mediada por CDRs é responsável em grande parte for diminuir a sinalização na membrana ao remover grandes quantidades de recetores ativos da superfície, neste trabalho propusemos que a internalização mediada por CDRs é uma via endocítica não canónica, envolvida na internalização e reciclagem/degradação do recetor da insulina. O objetivo principal deste trabalho é perceber o papel das CDRs na internalização do recetor da insulin, em contextos fisiológicos e fisiopatológicos. Especificamente, queríamos determinar se a insulina estimula a formação de CDRs em hepatócitos e células do musculo esquelético, se o recetor é sequestrado e internalizado através destas estruturas após estimulação com insulina, perceber o papel das CDRs nestas células, e finalmente explorar o impacto de elevados níveis de insulina e da sobre expressão da iNOS na formação de CDRs. Para responder à nossa primeira pergunta, utilizamos células Hepa 1-6 de hepatoma de murganho, para demonstrar a formação de CDRs. Neste trabalho, mostramos pela primeira que a estimulação com insulina promove a formação de CDRs nestas células, imediatamente 1 minuto após adição da insulina ao meio. A formação de CDRs é dependente do tempo de estimulação e da concentração de insulina. O pico no número de células a formar CDRs éatingido aos 5 minutos de estimulação, diminuindo para níveis basais aos 60 minutos. O mesmo padrão é observado para concentrações mais baixas de insulina, no entanto o aumento não é tão notável. A ativação das vias de sinalização por ligação de fatores de crescimento a recetores tirosina cinese é um processo extremamente rápido, o que confirmamos pela análise da ativação da via de sinalização da insulina através da fosforilação do recetor da insulina e do seu target, Akt. Como esperado, na ausência de um estímulo de insulina, mimetizando o estado de jejum, tanto o Receptor como o Akt não estão fosforilados. No entanto, num cenário de pós-prandial, com o aumento da concentração de insulina, ambos ficam fosforilados, logo após 1 minuto de estimulação. Avaliamos ainda a formação de CDRs em hepatócitos primários de murganho, células mais representativas da fisiologia do fígado. Confirmamos que a insulina também promove a formação de CDRs nestas células. O extraordinário aumento na formação de CDRs após estimulação com insulina conduziu-nos ao nosso objetivo seguinte. Após estimulação com insulina, o recetor encontra-se localizado nestas estruturas, o que demonstramos por imunofluorescência, pela co-localização com a actina o que sugere fortemente que a internalização do recetor da insulina é mediada por estas estruturas. O recetor encontra-se maioritariamente localizado na membrana plasmática, quando não existe insulina no meio, sendo sequestrado em CDRs após adição da hormona. A presença do recetor nestas estruturas começa a diminuir 30 minutos após estímulo, tendo sido completamente internalizado aos 60 minutos. Observação de células in vivo confirma estes resultados, já que também observamos a formação de CDRs na superfície dorsal das células estimuladas com insulina e transfectadas com InsR-GFP, confirmando a localização do recetor nestas estruturas. A seguir, investigamos o impacto do silenciamento do WAVE1, uma proteína fundamental na formação de CDRs, na via de sinalização da insulina. Confirmamos por imunofluorescência que o silenciamento do WAVE1 diminuiu fortemente a formação de CDRs estimulada pela insulina e diminuiu a fosforilação do Akt nos seus dois resíduos (Ser473, Thr308), o que indica uma inibição da via de ativação da insulina. Quisemos ainda perceber quais as consequências da exposição crónicas a elevadas concentrações de insulina e da sobreexpressão de iNOS, uma característica da inflamação, na formação de CDRs. Em células incubadas em meio que mimetiza condições de hiperinsulinemia, durante 48 horas, observamos uma diminuição drástica na formação de CDRs. Curioso perceber que esta diminuição acontece tanto em células que estiveram em jejum na ausência de insulina, permitindo-lhes recuperar, como em células onde a insulina esteve sempre presente no meio de cultura. Também a sobreexpressão de iNOS, mimetizando inflamação, provocou uma diminuição da formação de CDRs, assim como nos níveis totais e na fosforilação de recetor de insulina, e na fosforilação do Akt. Com este trabalho propomos que a endocitose do recetor da insulina mediada por CDRs funciona em paralelo com outros mecanismo, mediando a internalização do recetor. Mostramos que a formação de CDRs estimulada por insulina é um mecanismo comum a órgãos alvo da insulina, e que impedindo a sua formação, há uma diminuição na ativação da via da insulina. Além do mais, condições que mimetizam fisiopatologia, como hiperinsulinemia e inflamação subclínica, diminuem de forma dramática a formação de CDRs. A endocitose do recetor por esta via pode permitir às células reciclarem rapidamente o recetor de volta à superfície, ou permitir uma rápida diminuição do sinal, já que este mecanismo permite a internalização de grandes quantidades de recetores ativados na célula. Futuramente, pretendemos perceber como é que as CDRs influenciam a reciclagem/degradação do recetor da insulina.
Descrição
Palavras-chave
Circular dorsal ruffles Insulin receptor