NMS - Teses de Doutoramento em Medicina
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- Estratégias para o planeamento da gestão e mitigação da população canina errante em Portugal: uma abordagem integrada em Uma SaúdePublication . do Campo, Natália; Gomes, Pedro; Ribeiro, JoãoRESUMO: O forte vínculo humano-cão é amplamente discutido na atualidade, emergindo como uma área de interesse expressivo, nos mais diversos campos da investigação. Este estudo aprofunda as complexidades e os desafios globais, resultantes da interação entre cães e outras espécies vivas. Da partilha do mesmo ambiente, irrompe um novo paradigma, que nos direciona para abordagens integradas em Uma Saúde. Ao contemplar processos colaborativos e transdisciplinares, que priorizam de igual modo todos os seres, esta abordagem reposiciona numa perspetiva holística as várias dimensões da atividade humana, reconhecendo que a saúde humana está dependente da saúde do planeta como um todo. Propomo-nos a planear estratégias efetivas, que preconizem a gestão e a mitigação da população canina errante em Portugal, de forma ética, sustentada e custo efetiva, com benefício para os três pilares da Uma Saúde. Objetivamos primeiramente coletar informação sobre as Estratégias e Medidas Legais implementadas em Países da União Europeia, Reino Unido e Estados Unidos da América. Uma Revisão de Escopo conduziu à formulação de um Relatório de acordo com o acrónimo PESTAL e avaliou globalmente fatores externos Políticos, Económicos, Sociais, Tecnológicos, Ambientais e Legais. Adaptando o modelo proposto por Rüegg et al. (2018) desenhamos e descrevemos a Iniciativa Uma Saúde, referente ao abandono de cães e à gestão da população canina errante em Portugal. Delineada com recurso ao pensamento sistémico, introduzimos na medição de resultados e avaliação do seu desempenho, os princípios da Saúde Baseada em Valor (VBHC), aplicados na gestão em saúde Humana. Com base nesses pressupostos sugerimos métricas (KPIs), para medir resultados que geram alto Valor no âmbito da Uma Saúde. Explorando a complementaridade entre os dois conceitos, que apelidamos de Uma Saúde baseada em Valor (VBOH), definimos os passos chave para uma Agenda de Valor em Uma Saúde. Partes interessadas e/ou atores alavancam o sistema de modo distinto, tendo-se constituído importante fazer a sua diferenciação. A análise descritiva dos resultados do questionário KAP, dirigido aos Médicos Veterinários Municipais e Médicos Veterinários afetos aos CROs de Portugal, teve como finalidade gerar conhecimento sobre a realidade Portuguesa e produzir evidência científica referente à construção da Iniciativa Uma Saúde, contribuindo para encontrar soluções para a problemática. Alguns dos resultados destacam a importância de ações participativas com envolvimento comunitário (82%) e de ONGs (84%), campanhas de educação e literacia animal (85%). Sobrelotação dos CROs (83%), falta de recursos técnicos e humanos (92%) foram identificados como importantes “gargalos” que limitam as ações dos Médicos Veterinários, que defendem a esterilização obrigatória (81%) como principal medida de mitigação de cães errantes. A ocisão surge referenciada como medida de último recurso por 63% dos respondentes, 45% contraindicam-na em absoluto. Não obstante, 79% dos respondentes não concordam com a gestão atual da população canina errante em Portugal. Conclui-se que o VBOH ao propor soluções que se pretende que sejam custo efetivas, éticas e sustentadas direciona para resultados em Uma Saúde que verdadeiramente interessam à saúde planetária.
- Diagnosis and prognosis disease biomarkers on critically ill patients with COVID-19 towards a precision medicine - a machine learning approachPublication . Araújo, Rúben; Bento, Luís; Calado, CecíliaRESUMO: A pandemia provocada pelo COVID-19 (do inglês COVID-19 – Coronavirus Disease 2019) serviu de aviso sobre a fragilidade inerente dos sistemas de saúde globais, tendo perturbado de forma significativa e global, equilíbrios sociais, económicos e estruturas organizacionais clínicas. Esta crise evidenciou a necessidade de desenvolver biomarcadores robustos, com utilidade diagnóstica e prognóstica, para melhor orientar decisões clínicas, especialmente em contextos de unidades de cuidados intensivos (do inglês ICUs – Intensive Care Units). Embora o foco principal desta tese tenha sido a COVID-19, foram exploradas estratégias de descoberta de biomarcadores em condições clínicas distintas, incluindo infeção, mortalidade e delirium, com o objetivo de avaliar o seu potencial de generalização em doentes com COVID-19 internados em unidades de cuidados intensivos, independentemente da patologia subjacente. O trabalho aqui apresentado baseou-se na utilização de técnicas ómicas, nomeadamente a espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier (do inglês FTIRS – Fourier-Transform Infrared Spectroscopy), permitindo caracterizar o estado bioquímico do organismo no momento da colheita da amostra, através da medição de sinais provenientes de proteínas, lípidos, metabolitos e, em menor grau, ácidos nucleicos. Foi também aplicada uma abordagem direcionada à caracterização proteómica de citocinas, com recurso a métodos estatísticos e de aprendizagem automática (do inglês ML – Machine Learning) para identificar biomarcadores clinicamente relevantes em doentes com COVID-19 internados em unidades de cuidados intensivos. A metodologia adoptada baseou-se numa robustez analítica, aplicabilidade prática e possibilidade de implementação futura em diferentes coortes, com ferramentas automáticas acessíveis a todos, incluindo indivíduos sem formação prévia em programação, matemática ou estatística. As duas principais linhas de investigação focaram-se na identificação de biomarcadores para (i) diagnóstico de infeção e (ii) prognóstico de mortalidade. O uso de espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier permitiu desenvolver modelos especializados na deteção de infeção, incluindo a discriminação entre doentes infectados e não infectados, diferenciação entre infeções bacterianas e fúngicas, identificação do local de infeção, classificação por Gram e, inclusivé, uma identificação preliminar ao nível da estirpe. Paralelamente, os perfis de citocinas obtidos por ensaios multiplex, especialmente quando explorados através do uso de rácios complexos, permitiram a discriminação do estado de infeção em doentes de unidades de cuidados intensivos—incluindo a diferenciação por etiologia, local de infeção e classificação de Gram—e o desenvolvimento de modelos preditivos de mortalidade, permitindo superar indicadores tradicionais de cuidados intensivos, como o APACHE II (do inglês – Acute Physiology and Chronic Health Evaluation II), SAPS II (do inglês – Simplified Acute Physiology Score II) e SOFA (do inglês – Sequential Organ Failure Assessment), bem como métricas simples baseadas em concentrações individuais de citocinas. Estes resultados reforçam o benefício em combinar técnicas metabolómicas e proteómicas como ferramentas complementares para melhorar simultaneamente a sensibilidade e a interpretação contextual de biomarcadores em cuidados intensivos. Objectivos secundários incluíram a comparação entre o soro e plasma para aplicações em espectroscopia de infravermelho por transformada de Fourier, identificação de biomarcadores associados ao delirium e desenvolvimento de uma plataforma digital para automatizar projectos de investigação biomédica. O soro e o plasma apresentaram perfis espectrais distintos mas complementares. O plasma pode oferecer vantagens em determinados contextos de investigação, dependendo dos objectivos analíticos. Por sua vez, o soro oferece maior estabilidade de sinal, razão pela qual foi usado ao longo da tese—pelas melhores propriedades de conservação a longo prazo e ausência de interferência causada por fatores de coagulação. A espectroscopia de infravermelho por transformada de Fourier foi ainda utilizada na identificação de potenciais biomarcadores de delirium em doentes com COVID-19 internados em unidades de cuidados intensivos, alcançando métricas de classificação elevadas numa população clinicamente complexa. Por fim, foi desenvolvida a ferramenta ArsHive para apoiar a investigação biomédica através de uma plataforma intuitiva e acessível, que integra preprocessamento de dados, normalização, análise multivariada e aprendizagem automática, produzindo resultados prontos para publicação. Estes contributos adicionais reforçam o potencial de translação dos principais resultados desta tese e com eles promover uma adopção mais abrangente de abordagens baseadas em tecnologias ómicas, por forma a responder tanto aos constrangimentos em investigação como às exigências da prática clínica.
- Unveiling insulin degrading enzyme as a new therapeutic target for parkinson’s diseasePublication . Sousa, Luís; Miranda, Hugo; Macedo, Maria; Oliveira, RitaSummary Parkinson's disease (PD) affects over 11 million people worldwide, yet ~90% of cases are sporadic with unclear aetiology. Although genetic factors contribute, they account for only a fraction of disease burden, pointing to environmental and metabolic influences. Type 2 diabetes mellitus (T2DM) increases PD risk by 30–40%, with early-onset diabetics showing a hazard ratio of 3.8. A defining pathological hallmark of PD is the misfolding and aggregation of α-synuclein (aSyn) into Lewy bodies, driving dopaminergic neuron loss in the substantia nigra pars compacta. The resulting striatal dopamine depletion produces the classical motor features of PD, including bradykinesia and tremor, alongside diverse non-motor symptoms. T2DM is a chronic metabolic disorder characterized by hyperglycaemia resulting from insulin resistance and progressive β-cell dysfunction. Insulin-degrading enzyme (IDE) plays a crucial role in glucose homeostasis by degrading 50-70% of circulating insulin in the liver, making it a key regulator of systemic insulin levels. IDE dysfunction contributes to the hyperinsulinaemia characteristic of T2DM progression. IDE has also been shown to have chaperone-like activity that can prevent aSyn aggregation, and inverse IDE–aSyn relationships have been reported in pancreatic tissue from diabetic patients and in IDE knockout mice. Given diabetes as a major PD risk factor, this thesis investigated whether similar dynamics occur in brain tissue and whether IDE dysfunction mechanistically links metabolic disease to neurodegeneration. Using Thy1-aSyn transgenic mice, we conducted 36-week longitudinal assessments integrating metabolic, behavioural and regional brain biochemical analyses under normal chow (NCD) or high-fat diet (HFD). Transgenic mice appeared metabolically protected at baseline, with lower body weight and glucose levels, but showed disproportionate vulnerability under dietary challenge, revealing latent fragility. HFD accelerated PD phenotypes with temporal specificity: spatial working memory deficits arose 12 weeks earlier (24 vs 36 weeks) and motor impairments 4 weeks sooner with greater severity. Regionally, HFD selectively elevated midbrain aSyn, the site of dopaminergic degeneration, while sparing cortex, cerebellum and hippocampus. IDE responses were region-dependent, with the midbrain showing a twofold upregulation suggestive of compensation, diverging from peripheral inverse IDE–aSyn patterns. To establish IDE’s role, we characterised IDE knockout mice across 25 weeks. Sex stratification revealed marked differences. Male knockouts developed early glucose intolerance with paradoxical insulin hypersensitivity that normalised, while females maintained metabolically stable on normal chow but showed latent vulnerability under dietary stress. Behaviourally, male knockouts displayed pole test motor impairments independent of metabolic challenge, establishing IDE deficiency as a direct neurological risk factor. Females, exhibited subtler, diet-sensitive changes. Intriguingly, IDE loss also protected against specific HFD-induced cognitive and motor deficits, highlighting context-dependent functions. Brain aSyn levels were unchanged, suggesting effects independent of gross protein accumulation. To quantify motor dysfunction progression and phenotypic convergence, we performed high-resolution gait analysis across 86 locomotor parameters. In Thy1-aSyn mice, temporal progression revealed non-linear motor decline, with coordination parameters deteriorating by more than an order of magnitude between 20-36 weeks. Unexpectedly, HFD produced divergent rather than accelerated phenotypes, reprogramming locomotor patterns with opposite directional changes depending on age-diet combinations. IDE knockout mice exhibited distinct locomotor dysfunction with pronounced temporal and spatial coordination deficits under standard conditions that were paradoxically normalized under metabolic stress. Machine learning classifiers achieved 78-83% accuracy for early pathology detection and 96% for advanced disease stages. Analysis indicated qualitative locomotor reorganisation rather than simple deterioration, with mediolateral positioning variability, temporal coordination deficits, and spatial control disruption emerging as key discriminative features across disease models. Cross-cohort classification demonstrated notable phenotypic convergence: IDE knockout mice showed 72% directional alignment with PD-like gait signatures in feature-based analysis, while 15-19% of individual locomotor events were classified as transgenic-like. This convergence supports the concept that distinct molecular pathologies feed into shared downstream motor control vulnerabilities. Overall, this work reframes metabolic dysfunction from passive PD comorbidity to active disease modifier. The finding that metabolic stress accelerates rather than merely exacerbates pathology, combined with IDE's emergence as a molecular nexus linking metabolism to neurodegeneration, identifies novel therapeutic opportunities. These results support precision medicine strategies that consider sex, genetic architecture, metabolic status, sex, and disease stage when designing disease-modifying interventions for ageing populations.
- Exploring the role and therapeutic value of immunosuppressive low-density neutrophils subsets in breast cancerPublication . Correia, Bruna; Cabral, Maria; Jacinto, AntónioRESUMO : Mundialmente, o cancro da mama (CM) continua a ser a primeira causa de morte por cancro em mulheres, na sua grande maioria devido ao aparecimento de metástases. Com as taxas de incidência e mortalidade projetadas para aumentar até 2050, existe uma grande necessidade de estratégias inovadoras que ajudem a melhorar os cuidados desta doença. Tem surgido um crescente interesse em relação ao microambiente tumoral, onde as células do sistema imune, incluindo os neutrófilos, aparecem como importantes modeladores da progressão tumoral e da resposta à terapia. Os neutrófilos, agora reconhecidos como uma população altamente heterogénea, desempenham um papel dual no cancro, exibindo funções tanto antitumorais (N1) como pró-tumorais (N2). Em circulação, os neutrófilos podem ser divididos em neutrófilos de alta densidade (NAD) e neutrófilos de baixa densidade (NBD), refletindo funcionalmente as características dos N1 e N2, respetivamente. Níveis elevados de neutrófilos tanto no sangue como em tumores têm sido associados a piores prognósticos em vários tipos de cancro, incluindo o CM, sugerindo o seu papel na progressão da doença e levando ao crescente interesse em estratégias terapêuticas baseadas em neutrófilos. No entanto, a aplicação destas abordagens continua limitada devido à heterogeneidade desta população. Assim, identificar subgrupos específicos de neutrófilos, bem como compreender as suas contribuições específicas para a progressão da doença, é fundamental para o desenvolvimento de melhores biomarcadores e/ou alvos terapêuticos. Com base num estudo anterior da nossa equipa, em que associamos os NBD a pior resposta à quimioterapia neoadjuvante e a estadios avançados de CM, no presente estudo, o nosso objetivo foi clarificar o impacto clínico destas células em CM metastático, assim como o seu papel na progressão da doença. Além disso, procurámos identificar e investigar subgrupos específicos de NBD com relevância clínica. Os NBD acumulam-se no sangue de doentes com CM, particularmente naqueles com doença metastática. Nestes doentes, níveis elevados de NBD associaram-se a uma progressão mais rápida da doença e a sobrevida reduzida, independentemente do local de metástases e do subtipo de CM. Uma análise longitudinal revelou ainda que flutuações nos níveis de NBD refletem o estado clínico das doentes, sendo que níveis elevados se correlacionaram com eventos clínicos adversos, enquanto níveis mais baixos estiveram associados a doença estável. Funcionalmente, os NBD exibiram propriedade pró-tumorais, incluindo a elevada expressão de PD-L1, TLR4, MMP-9 e VEGF, contribuindo para imunossupressão, progressão tumoral e metástases. Ao contrário dos NAD, que demonstraram ser citotóxicos contra células tumorais, os NBD não levaram a uma redução da viabilidade de linhas celulares de CM em culturas 3D. Notavelmente, linhas celulares de CM expostas ao meio-condicionado por NBD demonstraram maior capacidade invasiva e maior proliferação. Este meio-condicionado por NBD também promoveu um fenótipo anti-inflamatório em células mieloides e levou à inibição de células T, provavelmente através do efeito inibitório da arginase. Notavelmente, também identificámos um subgrupo particular de neutrófilos não descrito anteriormente, que expressa o recetor de quimiocinas CCR4 e que se encontra aumentado dentro da fração dos NBD. Os CCR4+NBD e os seus ligandos CCL17 e CC22 estão significativamente aumentados em doentes com CM metastático, sugerindo a sua associação à agressividade da doença. Clinicamente, os CCR4+NBD pareceram ser um fator preditivo do estado clínico de doentes com CM metastático mais robusto do que os NBD totais, associando-se com rápida progressão da doença e sobrevida reduzida. Flutuações nos seus níveis também coincidiram melhor com alterações na doença. Isto realça o potencial deste subgrupo de neutrófilos como biomarcadores de prognóstico e de monitorização da doença. Funcionalmente, os CCR4+NBD demonstraram maior capacidade migratória em resposta a CCL17/22 e a linhas celulares de CM, sugerindo o seu preferencial recrutamento para o tumor. De facto, também detetámos a presença de neutrófilos CCR4+ em tumores da mama, o que reforça a relevância do nosso estudo. Estas células também exibiram um fenótipo imunossupressor pronunciado, com expressão de PD-L1 e atividade da arginase significativamente aumentadas, em comparação com a restante população de NBD, levando a uma inibição da ativação das células T mais forte. É ainda de realçar, que na presença dos CCR4+NBD, o bloqueio de PD-1 não levou à recuperação total das funções das células T, sugerindo que este subgrupo de neutrófilos possa contribuir para a resistência a inibidores de checkpoint imunológicos. Consistentes com esta observação, dados preliminares de doentes com CM triplo-negativo tratados com pembrolizumab (anti-PD-1) mostraram que flutuações nos níveis de CCR4+NBD refletem a resposta ao tratamento, realçando o seu potencial como biomarcadores dinâmicos da resposta à imunoterapia. Por fim, para complementar as nossas observações, fizemos uma análise transcriptómica do perfil de neutrófilos circulantes de doentes com CM metastático. Apesar da variabilidade entre doentes, os NAD e os NBD segregaram-se em grupos diferentes, confirmando que estas subpopulações são distintas tanto a nível funcional como transcriptómico. Comparados com os NAD, os NBD exibiram vários genes positivamente regulados relacionados com funções pró-tumorigénicas e imunossupressoras, emonstrando as suas adaptações específicas ao cancro. Nesta tese revelamos novas evidências que estabelecem o papel importante que os NBD têm na progressão e agressividade do CM. Além disso, identificamos os CCR4+NBD como sendo um subgrupo de neutrófilos provavelmente associados de forma mais específica ao cancro e com elevada relevância clínica. Os nossos resultados sugerem que incorporar a monitorização destas células na prática clínica pode ajudar a identificar doentes de maior risco e permitir abordagens mais personalizadas. Por fim, este estudo reforça a relevância de usar como alvos mecanismos específicos dos neutrófilos patológicos, como é o caso do eixo CCR4-CCL17/22, no desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas. Em última instância, abordar os neutrófilos e as suas funções no contexto do cancro tem um grande potencial em aplicações clínicas futuras, com o objetivo de melhorar os cuidados aos doentes com CM e mitigar a sua contribuição para mortes prematuras entre estes doentes.
- The role of metabolism in the regulation of neural stem cell fate and proliferation in Drosophila melanogasterPublication . Melo, Eunice; Homem, CatarinaRESUMO: As células estaminais dependem de uma regulação metabólica rígida para manter o equilíbrio entre a autorrenovação e a diferenciação, um processo essencial para o desenvolvimento adequado dos tecidos e para a manter a homeostase. O metabolismo de um carbono é uma via central que liga a disponibilidade de nutrientes a processos celulares vitais, incluindo a biossíntese de nucleótidos, o equilíbrio redox e a regulação epigenética. Apesar da sua relevância estar amplamente documentada em sistemas mamíferos, o papel específico do metabolismo de um carbono nas células estaminais neurais e no desenvolvimento do cérebro permanece pouco caracterizado. Esta lacuna é ainda mais evidente em modelos invertebrados, particularmente no contexto do desenvolvimento neural em Drosophila melanogaster (referenciado como Drosophila). Para colmatar esta falha, utilizámos Drosophila como organismo modelo, para investigar os mecanismos através dos quais o metabolismo de um carbono regula o destino das células estaminais neurais e o desenvolvimento do tecido neural. Começámos por avaliar o impacto da desregulação do metabolismo de um carbono na diferenciação e proliferação das NSCs da Drosophila, denominadas neuroblastos (NBs), no cérebro central (CB). Através do uso de RNA de interferência específica para as enzimas do ciclo de um carbono, silenciámos oito enzimas-chave deste ciclo e analisamos os efeitos na proliferação, crescimento e diferenciação dos NBs. Identificámos as enzimas Serina hidroximetiltransferase (Shmt), a timidilato sintetase (Ts) e a Adenosilhomocisteinase (Ahcy) como essenciais para a diferenciação adequada dos NBs, uma vez que a sua supressão prolongou o tempo de vida dos NBs e comprometeu a progressão normal das suas linhagens, especialmente nos NBs do tipo II. Estes resultados evidenciam o papel fundamental do metabolismo de um carbono na promoção da diferenciação atempada e na manutenção das linhagens celulares, talvez através da síntese de nucleótidos e à preservação da estabilidade epigenética. Adicionalmente, investigámos se o metabolismo de um carbono também desempenha algum papel relevante no desenvolvimento neural precoce, focando-nos no lóbulo óptico (LO), onde as células neuroepiteliais (NE) transitam para NBs durante a fase larval. Demonstrámos que a Shmt é essencial para a proliferação, sobrevivência e organização das células NE. A falta de Shmt nos lóbulos ópticos revelou um aumento do apoptose, redução da expansão neuroepitelial e falha na formação da lamina furrow, culminando na perda de neurónios da lâmina. Estes resultados revelam um papel mais amplo do metabolismo de um carbono na manutenção da integridade epitelial, no suporte à função das células estaminais e na garantia da formação neuronal. Para explorar de forma mais aprofundada a dinâmica metabólica subjacente à regulação das células estaminais, desenvolvemos um biossensor geneticamente codificado para detectar os níveis intracelulares de S-adenosilmetionina (SAM), o principal doador de grupos metil no ciclo de um carbono. Usando um sistema sintético derivado de levedura desenhamos versões do biossensor fluorescente (SFB) e luminescente (SLB). Estes biossensores foram testados em células S2 de Drosophila e em células P19 mamíferas. Embora o sensor baseado em luciferase necessite de otimizações adicionais, o SFB permitiu a deteção eficaz de SAM intracelular, estabelecendo as bases para futuros perfis metabólicos em tecidos vivos. Em suma, esta tese demonstra que o metabolismo de um carbono um é um regulador central das transições das células estaminais neurais e da morfogénese dos tecidos em Drosophila melanogaster. Ao combinar manipulação genética e análise do desenvolvimento, mostramos que as vias metabólicas estão profundamente interligadas com o tempo de desenvolvimento, a especificação da linhagem e a competência das células estaminais. Este trabalho não só permite o entendimento do controlo metabólico da neurogénese, como também fornece novas ferramentas e abordagens para investigar como o metabolismo celular se relaciona com o desenvolvimento e a doença.
- DAND5 as a regulator of differentiation and mature readiness of PSC-CMSPublication . Almeida, Micael; Belo, José; Futschik, Matthias; Inácio, JoséRESUMO: A doença cardiovascular (CVD) continua a ser a principal causa de morte globalmente, sendo o enfarte do miocárdio (IM) o maior contribuidor. As abordagens terapêuticas atuais são limitadas em regenerar de forma eficaz o tecido cardíaco danificado. As estratégias atuais para regeneração/reconstituição do coração visam a remodelação cardíaca através da reparação do tecido danificado com uma fonte celular externa ou estimulando as células existentes a proliferar e repovoar a área comprometida. A reprogramação celular aborda este desafio e oferece uma solução promissora, convertendo fibroblastos e outros tipos celulares em cardiomiócitos (CMs) funcionais, seja revertendo células para um estado pluripotente ou transitando diretamente de linhagem celular. Várias estratégias, tais como edição genética e a aplicação de microRNAs e pequenas moléculas, foram exploradas pelo seu potencial em melhorar a regeneração cardíaca. Essas estratégias tiram proveito da plasticidade celular introduzindo fatores de reprogramação que fazem regredir a maturidade celular in vitro, permitindo a sua posterior diferenciação e, assim, endossando o transplante celular, ou promovendo a proliferação celular in situ, promovida por suportes embebidos com fatores pró-regenerativos promovendo uma eficiente restauração cardíaca. Apesar de avanços notáveis, persistem desafios importantes, incluindo baixa eficiência de reprogramação, limitações na maturação celular e preocupações de segurança em aplicações clínicas. Notavelmente, a modulação da expressão de DAND5 mostrou potencial em responder a algumas destas limitações. Níveis reduzidos de DAND5 têm sido associados a aumento da proliferação de CMs e a um incremento de progenitores cardiovasculares, prolongando também o seu estado progenitor. Através da modulação de DAND5, é possível melhorar a geração e a eficiência de proliferação de CMs derivados de células estaminais pluripotentes induzidas humanas (hiPSC-CMs) e, posteriormente, promover a maturação fisiológica através da transição metabólica de glicose para ácidos gordos. Este estudo explorou o papel de genes reguladores recentemente caracterizados associados ao DAND5 na cardiogénese, bem como o potencial de maturação dos nossos hiPSC-CMs DAND5-mutante nulo (KO). A integração destas abordagens inovadoras oferece uma alternativa promissora para restaurar a função cardíaca e reduzir a dependência de transplantes cardíacos completos.
- REScue-MI Project. Assessment of the safety and efficacy of microbiota transplant in restoring the intestinal microbiota of patients with clinical indication for treatmentPublication . Dinis, Liliana; Marques, Cláudia; Pestana, DiogoRESUMO: O transplante de microbiota intestinal (TMI) tem vindo a afirmar-se como uma estratégia terapêutica segura e eficaz, especialmente no tratamento da infeção recorrente por Clostridioides difficile. O sucesso clínico do TMI está frequentemente associado à capacidade de as bactérias do dador colonizarem de forma eficaz e sustentada o intestino do recetor após o transplante. No entanto, a obtenção de uma colonização duradoura continua a ser um desafio, devido à resiliência intrínseca da microbiota intestinal e às características específicas do recetor, que influenciam a resposta individual ao TMI e podem comprometer a sua eficácia a longo prazo. O conceito de "super-dadores" — indivíduos cuja microbiota promove de forma consistente uma colonização robusta e sustentada — tem despertado crescente interesse. Ainda assim, os fatores que determinam a eficácia da colonização e a persistência microbiana nos recetores permanecem pouco compreendidos. A atual evidência cientifica sugere que tanto a diversidade microbiana do dador como a compatibilidade funcional com a microbiota do recetor são determinantes essenciais para alcançar uma colonização duradoura e resultados terapêuticos favoráveis. No entanto, apesar de ser reconhecido que alguns fatores do hospedeiro e ambientais influenciam fortemente a composição e diversidade da microbiota intestinal, estes continuam a ser amplamente negligenciados nas atuais diretrizes de rastreio de dadores. Este trabalho propõe que a seleção ideal de dadores deve privilegiar características associadas ao aumento da diversidade microbiana, recorrendo a um protocolo alinhado com as normas clínicas de segurança, mas que integre também critérios de pré-seleção como idade, estilo de vida, índice de massa corporal e hábitos alimentares. Adicionalmente, esta tese investigou se uma seleção de dadores mais refinada poderia potenciar a colonização bacteriana e melhorar os resultados clínicos após o TMI. O estudo foi conduzido em duas fases. A primeira fase, desenhada como um estudo transversal, envolveu o recrutamento e triagem de potenciais dadores de fezes, utilizando um protocolo de seleção que incorporou critérios de exclusão definidos por guidelines, avaliações da dieta, incluindo o rastreio de adesão à Dieta Mediterrânica (MD), e restrições etárias (dadores elegíveis entre os 18 e os 35 anos), com o objetivo de identificar fatores dietéticos e de estilo de vida associados à diversidade da microbiota intestinal. Neste estudo, 54 participantes compareceram à entrevista clínica e avaliados quanto à elegibilidade. Destes, 14 foram considerados pré-elegíveis e 2 foram selecionados como dadores de fezes após a terceira fase de rastreio. Estes resultados evidenciam que a elegibilidade de potenciais dadores, mesmo entre adultos jovens é reduzida. O Dador 1 cumpriu todos os critérios de diferenciação, incluindo uma pontuação de adesão à dieta mediterrânica (DM) superior a 10 e um índice de diversidade de Shannon acima da mediana do grupo (4,8). Por sua vez, o Dador 2 apresentou uma pontuação de adesão á DM inferior a 10 e um índice de Shannon abaixo da mediana. Respostas afirmativas à presença de condições neurológicas e psiquiátricas constituíram um dos principais fatores de exclusão e estiveram associadas a alterações significativas na composição da microbiota intestinal. Adicionalmente, foi desenvolvida uma ferramenta preditiva para apoiar futuras estratégias de seleção de dadores, identificando indivíduos com maior diversidade da microbiota com base em cinco hábitos alimentares específicos. Na segunda fase, foi conduzido um estudo longitudinal prospetivo com o objetivo de avaliar a eficácia do TMI, definida pela capacidade de colonização da microbiota do dador, bem como a segurança e a resposta clínica, através de indicadores de qualidade de vida (QdV) em doentes submetidos a TMI. Os recetores foram acompanhados às 2 e 12 semanas após o transplante, com recolha de amostras de fezes para sequenciação do gene 16S rRNA, paralelamente às avaliações de segurança e QdV. Ao longo de um período clínico observacional de 10 meses, três doentes receberam TMI proveniente dos dois dadores selecionados. Os padrões de colonização observados variaram entre os recetores. O doente R11, que recebeu TMI do Dador 1, apresentou uma colonização microbiana mais sustentada, acompanhada de melhorias na qualidade de vida, sugerindo um potencial benefício associado a uma seleção diferenciada de dadores. Em contraste, os doentes R12 e R13, que receberam TMI do Dador 2, exibiram perfis distintos de colonização: O R12 demonstrou uma colonização limitada e transitória, regressando a um perfil de microbiota semelhante ao basal às 12 semanas; o R13 apresentou uma colonização menos consistente do que a do R11, embora relativamente estável, mantendo às 12 semanas um perfil distinto tanto do basal como do dador, e registou a menor melhoria na qualidade de vida entre os três recetores. A nível taxonómico, embora o filo Firmicutes (Bacillota) tenha contribuído com o maior número de ASVs colonizantes, os ASVs do filo Bacteroidota apresentaram, em média, os aumentos relativos mais expressivos. Estes resultados reforçam o carácter individualizado da colonização microbiana e sublinham a importância de considerar simultaneamente as características do dador e do recetor na otimização dos resultados do TMI.
- Understanding the impact of late-onset Alzheimer’s disease mutations in CD2AP on synapsesPublication . Castanheira, Jorge; Almeida, Cláudia Guimas; Lopes, LuísaResumo A doença de Alzheimer (DA) é um distúrbio neurodegenerativo progressivo caracterizado pela perda de memória e declínio cognitivo, sendo a principal causa de demência em todo o mundo. Enquanto a DA de início precoce é frequentemente impulsionada por mutações autossómicas dominantes raras em genes como APP, PSEN1 e PSEN2, a DA de início tardio (LOAD) surge de uma interação complexa entre fatores de risco genéticos e influências ambientais. A forma como estes genes de risco contribuem para a progressão da doença continua a ser pouco compreendida. Embora a investigação da DA se tenha focado historicamente na patologia da beta-amiloide (Aβ) e da tau, evidências crescentes indicam que a disfunção sináptica é um impulsionador central e precoce do declínio cognitivo na LOAD. Um dos fatores de risco genéticos mais fortes para a LOAD é a proteína associada ao CD2 (CD2AP), mas a sua função no cérebro e o seu contributo para a falha sináptica permanecem largamente inexplorados. O nosso trabalho anterior mostrou que a perda de CD2AP altera o tráfego endossomático e aumenta a produção de Aβ, sugerindo que a CD2AP liga o risco genético à patologia clássica da DA. Aqui, estendemos esta visão ao mostrar que a CD2AP também desempenha um papel crucial na manutenção da estrutura e função das ligações sinápticas. Quando os níveis de CD2AP são reduzidos, os neurónios perdem muitas das suas sinapses, que se tornam mais pequenas e fracas, e a atividade global da rede diminui. Em contraste, níveis mais elevados de CD2AP suportam ligações mais fortes e estáveis entre os neurónios. Analisámos adicionalmente uma variante da CD2AP associada à doença e descobrimos que esta perturba a arquitetura normal das sinapses, levando a contactos anormais e com funcionamento deficiente entre as células cerebrais. Estas descobertas sugerem que algumas formas genéticas de Alzheimer interferem diretamente nos mecanismos que permitem às sinapses formarem-se, estabilizarem-se e remodelarem-se. Crucialmente, os defeitos sinápticos causados pela alteração da CD2AP não foram revertidos pelo bloqueio da beta-amiloide, indicando que esta via pode impulsionar danos sinápticos independentemente das características clássicas da DA. Como a aprendizagem e a memória dependem da capacidade de as sinapses mudarem a sua forma e força, os nossos resultados identificam a CD2AP como um regulador-chave da plasticidade cerebral. Ao influenciar tanto a estrutura interna das sinapses como o movimento dos recetores de neurotransmissores, a CD2AP ajuda a determinar se as ligações neuronais são fortalecidas ou perdidas ao longo do tempo. A perturbação deste sistema pode, portanto, contribuir para a degradação progressiva dos circuitos neurais e para o declínio cognitivo na doença de Alzheimer de início tardio.
- Toxicological profile of cellulose nanomaterials in human gastrointestinal cellsPublication . Vital, Nádia; Louro, Henriqueta; Kranendonk, Michel; Silva, Maria JoãoResumo: Os nanomateriais de celulose (CNMs) são um grupo importante de nanomateriais (NMs) produzidos a partir de celulose, com aplicações em vários setores, incluindo biomedicina, alimentos e embalagens alimentares. Podem ser obtidos a partir de diferentes matériasprimas naturais e de resíduos agrícolas, e, por isso, têm um grande potencial como materiais sustentáveis. Devido à sua origem natural, os CNMs são habitualmente considerados biocompatíveis e não tóxicos. No entanto, o facto de que estes materiais podem adquirir diferentes propriedades biológicas à escala manométrica, e de serem nanofibras, suscita preocupações quanto a possíveis acontecimentos celulares e moleculares, incluindo genotoxicidade, que podem conduzir a resultados adversos (AO) na saúde humana, como cancro. Há, assim, necessidade de identificar potenciais AO que possam resultar da ingestão de CNMs, nas fases iniciais do seu desenvolvimento para aplicações em alimentos, antes de se considerar a sua comercialização. O principal objetivo deste projeto foi investigar os efeitos genotóxicos e epigenéticos de duas nanofibras de celulose em células intestinais humanas, contribuindo assim para responder à seguinte questão: os CNMs ingeridos induzem efeitos adversos no trato gastrointestinal (GIT)? As duas novas nanofibras de celulose investigadas foram obtidas a partir de polpa de Eucalyptus globulus e produzidas usando dois métodos diferentes: via tratamento enzimático (CMF-ENZ) ou via modificação química por oxidação mediada por TEMPO (radical 2,2,6,6-tetrametilpiperidina-1-oxil) (CNF-TEMPO). Iniciou-se este estudo pela revisão da literatura relativa a CNMs similares, de forma a recolher informação acerca da sua toxicidade, permitindo identificar lacunas de conhecimentos relevantes para a exposição oral a estes NMs. Embora muitos estudos tenham sugerido a biocompatibilidade das CNFs, a maioria destes não abordou os efeitos genotóxicos in vitro e in vivo devidos à exposição oral, assim como o seu potencial de carcinogenicidade. Uma nova abordagem metodológica (NAMs) foi implementada, utilizando uma estratégia baseada num conjunto de testes in vitro complementares para investigar diferentes acontecimentos moleculares, acoplada a um modelo de simulação de digestão humana in vitro, recorrendo a dois modelos celulares intestinais humanos (Caco-2 e HT29-MTX-E12). A adaptação do modelo de digestão in vitro, para permitir a sua aplicação em ensaios biológicos com CNMs foi um desafio inicial. Posteriormente, a investigação incluiu citotoxicidade, genotoxicidade (mutação genética, danos no DNA e lesões cromossómicas), produção de espécies reativas de oxigénio (ROS) e efeitos epigenéticos. A influência do processo de digestão nos resultados toxicológicos também foi investigada. A aplicação do conjunto de ensaios in vitro sugere que um potencial genotóxico não pode ser excluído para nenhum dos CNMs. Embora não tenham sido observadas alterações cromossómicas nem mutagenicidade, foram detetados danos no DNA, após baixasconcentrações de CNF, que são realistas para a exposição humana. Ambos os CNMs provocaram efeitos epigenéticos que afetam diversas vias funcionais celulares. Diferentes padrões de metilação de DNA foram observados para CNMs não digeridos e digeridos, e regiões diferencialmente metiladas (DMR), e genes metilados foram identificados. A análise de vias revelou que CMF-ENZ e CNF-TEMPO impactaram vias relacionadas ao metabolismo de glicosaminoglicanos, possivelmente envolvidos na proliferação celular. A CMF-ENZ afetou a reparação do DNA, enquanto a CNF-TEMPO afetou vias associadas ao metabolismo do glucagon. Os CNMs digeridos, particularmente CNFTEMPO, afetaram a via de sinalização ERBB2/PIK3, conhecida como implicada na carcinogénese. A nova abordagem metodológica aqui implementada, com base na digestão simulada in vitro acoplada à análise de genotoxicidade e epigenómica, forneceu novas pistas sobre vias biológicas que podem ser afetadas, que vão além da avaliação clássica de toxicidade de substâncias a serem utlizadas em alimentos. Os dados obtidos evidenciam os efeitos dos CNMs no primeiro local de contato após a ingestão e estabelecem a base para investigação mecanística e toxicológica adicionais.
- Retinal Pigment Epithelium fluorescence and vascularization in advanced age-related macular degeneration: comprehensive analysis from bench to imagingPublication . Reis Cabral, Diogo; Pais, Diogo; Seabra, MiguelResumo: A vascularização macular consiste numa rede complexa de capilares com dimensões inferiores a um fio de cabelo humano. A microcirculação nessa rede segue um sistema intricado que deve obedecer a particularidades neurofisiológicas, óticas e metabólicas para assegurar o funcionamento de células altamente exigentes. A interrupção da organização deste circuito está associada a isquemia e disfunção irreversível da retina. Por estas razões, compreender a organização do fluxo sanguíneo na mácula é considerado um aspeto fundamental no estudo das doenças maculares. Trabalhos pioneiros em histologia de primatas e humanos, conjuntamente com técnicas microscópicas, identificaram até quatro redes vasculares na mácula perifoveal. No entanto, a impossibilidade de estudar cortes histológicos ou imagens de angiografia de modo tridimensional impediu obter informações precisas sobre a conectividade vascular, que permaneceu, durante décadas, alvo de especulação. Na última década, os avanços tecnológicos em imagens não invasivas permitiram o estudo in vivo da microvasculatura da retina, revelando detalhes sem precedentes. Neste projeto pretendemos caracterizar a conectividade vascular na mácula humana e investigar as suas implicações clínicas usando Tomografia de Coerência Óptica (OCT). Começamos o nosso estudo pela aplicação de uma nova abordagem que permite visualização tri-dimensional dos vasos da retina humana. Trabalhamos com dados com resolução lateral superior ao OCT comercial obtidos através de OCT-Angiografia por dense B-scan (DB-OCTA). Nestes dados, aplicámos o algoritmo do caminho mais curto para avaliar as conexões entre as artérias e as veias superficiais da parafóvea. Metodologicamente, começamos por criar uma pipeline que permitisse acesso aos dados de OCT antes do processamento pelo software do fabricamente (raw data/dados brutos), o que permitiu trabalhar imagens com mais informação. Posteriormente, desenhamos um fluxo de trabalho no software de microscopia Imaris v9.5 (Bitplane, Andor Technology plc.) que permitiu visualizar e analisar os capilares da mácula humana com elevada fiabilidade. A aplicação desta metodologia mostrou que o trajeto mais curto entre artérias e veias na para-fovea segue através do plexo vascular profundo (DVC), contrariamente ao pensamento intuitivo clássico de um curso através de diferentes plexos vasculares dispostos em paralelo entre o lado arterial e o lado venoso da circulação. As nossas observações sustentaram a existência de uma organização em série na microcirculação mácula na qual qual a maior parte da drenagem venosa se origina no complexo vascular profundo (DVC). Este nosso trabalho abriu caminho para a aplicação desta metodologia para visualização e análise de dados de modo tridimensional aplicada em dados com maior resolução, e em casos de estudo com patologia. Na segunda tarefa desta tese caracterizamos a conectividade do fluxo sanguíneo macular usando um novo protótipo de OCT com o dobro da resolução axial dos aparelhos convencionais: o OCT de alta resolução (HighRes OCT). Iniciamos este estudo tendo como base o conhecimento prévio sobre trabalho com dados brutos de OCT. Desenvolvemos uma nova abordagem para avaliar a conectividade dos vasos maculares combinando imagens vasculares obtidas a partir do OCT estrutural com imagens vasculares derivadas do fluxo detetado pelo OCT-Angiografia. Esta abordagem permitiu-nos avaliar a conectividade ao nível do DVC sem as limitações de projeção do sinal do plexo superficial nos plexos profundos que limita o uso do OCT-Angiografia na análise da conectividade vascular. Neste capítulo mostramos que o padrão de conectividade vascular macular obtido através da análise dos capilares no OCT estrutural é mais consistente com as descobertas da microscopia confocal do que com análises baseadas na análise do fluxo do OCT-Angiografia. A análise da microcirculação macular através desta metodologia permitiu identificar uma organização híbrida do fluxo sanguíneo dentro da mácula perifoveal humana, com um arranjo em série entre o plexo superficial e o profundo. As principais contribuições deste trabalho consistiram na sistematização e identificação de padrões normais de conectividade vascular que podem ser testados em diferentes doenças maculares. Por fim, aplicamos a avaliação dos padrões de conectividade vascular em dois contextos clínicos diferentes: a degeneração macular da idade (DMI) e neurorretinopatia macular aguda (AMN). Na DMI, usamos OCT e OCTA de alta resolução para investigar a estrutura tridimensional e a conectividade vascular em situações de neovascularização macular tipo 3 e alterações microvasculares do plexo capilar profundo. A nossa análise distinguiu alterações microvasculares não neovasculares, e que levam à exsudação intrarretiniana, de neovascularização macular tipo 3. Acreditamos que as particularidades destas lesões não neovasculares mereciam terminologia descritiva própria e propusemos “Deep Retinal Age-related Microvascular Anomalies” (DRAMA) para as descrever. Categorizar os DRAMA pode ser útil na prática clínica, uma vez que estas alterações microvasculares podem mimetizar a neovascularização macular mas têm um prognóstico mais favorável e a abordagem terapêutica pode ser diferente. Na AMN, a nossa análise identificou dois padrões distintos de alterações do plexo vascular profundo que sugeriram o comprometimento dos vórtices capilares e das vénulas de drenagem como tendo um papel central no mecanismo da doença. Destacamos ainda a importância de considerar a anatomia das fibras de Henle (ou seja, a distorção dos axónios dos fotorreceptores e das fibras das células de Müller fora da fovéola) no estudo de doenças vasculares da circulação da retina interna que afetam a função dos fotorreceptores. Esta dissertação estabelece uma ponte entre o estudo da morfologia microcirculação macular e algumas implicações clínicas. O nosso trabalho contribui não só para uma melhor compreensão dos mecanismos da doença na DMI e na AMN, mas também sublinha a importância de, através dos exames de imagem, aprimorarmos a categorização dos diagnósticos clínicos, o que possibilita estratégias de tratamento mais personalizadas para as doenças maculares;