NMS - Teses de Doutoramento em Medicina
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- Predicting depression in adult portuguese population: development and validation of a prognostic modelPublication . Sousa, Rute Dinis de; Rodrigues, Ana; Caldas-de-Almeida, José M.RESUMO: Enquadramento. A depressão é uma das principais causas de anos vividos com incapacidade e um desafio persistente para o sistema de saúde português. Não obstante a prevalência elevada, os sintomas evoluem de forma heterogénea: a maioria apresenta níveis baixos ou em melhoria, enquanto uma minoria segue trajetórias crescentes ou persistentemente elevadas que concentram incapacidade, utilização de cuidados e custos sociais. Objetivos. Caracterizar a prevalência e os gradientes de sintomas depressivos na população adulta em 2021; sintetizar a evidência longitudinal sobre trajetórias de sintomas em adultos; identificar trajetórias ao longo de dez anos numa coorte nacional e os seus correlatos sociais, clínicos e comportamentais; e quantificar a carga e os custos das formas graves de depressão em Portugal. Para tal, foram desenvolvidos quatro estudos com os seguintes objetivos específicos: I)Estimar a prevalência de sintomatologia depressiva e caracterizar correlatos sociodemográficos, clínicos e de estilos de vida (EpiDoC-4, março–julho de 2021). II)Rever sistematicamente a evidência longitudinal recente sobre trajetórias de sintomas depressivos em adultos. III)Identificar trajetórias de sintomas ao longo de 10 anos (2011–2021) numa coorte nacional representativa (EpiDoC 1–2–4) e examinar associações com multimorbilidade e padrões sustentados de atividade física. IV)Estimar a carga de doença (DALY) e os custos diretos e societais da depressão resistente ao tratamento (TRD) e da depressão major com risco de suicídio (MDSR), por ano de referência 2017. Métodos. Tese por publicações, com quatro estudos complementares. Estudo 1: análise do EpiDoC-4 (25/03–31/07/2021), amostra probabilística representativa de adultos residentes em Portugal, recolha por entrevista telefónica assistida por computador; sintomas depressivos mensurados pela HADS-D (versão validada para Portugal); aplicação de ponderadores amostrais, estimativas de prevalência e modelos multivariáveis com variância robusta para gradientes sociodemográficos, clínicos e comportamentais. Estudo 2: revisão estruturada da evidência longitudinal em adultos (dois ou mais momentos), com pesquisa sistemática, dupla triagem, extração padronizada, apreciação metodológica e síntese temática de classes de trajetória, determinantes e consequências, privilegiando transparência de modelação e reporte. Estudo 3: coorte EpiDoC 1–2–4 (2011–2021): modelação ao nível do item (modelo de resposta graduada) para obter escores latentes comparáveis entre vagas; identificação de trajetórias centradas na pessoa com seleção por critérios de ajuste/informatividade/interpretabilidade; estimação de associações com padrões sustentados de actividade física (aderência às recomendações da OMS ao longo das vagas) e multimorbilidade (≥2 condições crónicas), via modelos multinomiais ajustados; estratégias de gestão de dados em falta e análises de sensibilidade pré-especificadas. Estudo 4: carga de doença e custos em 2017 para TRD e MDSR, com definição explícita de casos a partir de fontes nacionais; cálculo de DALY (YLD por prevalência e pesos de incapacidade; YLL por mortalidade) e custos diretos (perspetiva do SNS) e societais (perdas de produtividade por absentismo/presenteísmo e morte prematura; ano-base de preços constante), com desagregação e verificações de consistência. Todos os procedimentos observaram aprovação ética e consentimento informado; gestão de dados e segurança seguiram normas institucionais. Resultados. Em 2021, 12% dos adultos reportaram sintomas depressivos; a carga da doença foi superior em mulheres, idosos, pessoas com multimorbilidade, residentes nas ilhas/Alentejo e em dificuldade económica, e inferior com maior escolaridade e exercício regular. A síntese longitudinal convergiu num pequeno conjunto de trajetórias (baixa-estável, em melhoria, em agravamento, alta-estável) com correlatos consistentes e piores desfechos funcionais/utilização de cuidados nas trajetórias adversas. Na coorte nacional EpiDoC, identificaram-se quatro trajetórias em 10 anos (baixa-estável 56,5%, decrescente 16,8%, crescente 15,5%, alta-estável 11,2%); a atividade física sustentada alinhou-se com cursos mais favoráveis e a multimorbilidade concentrou-se em cursos adversos; mulheres e pessoas com menor escolaridade estiveram sobre-representadas nas trajetórias de maior sintomatologia. Em 2017, TRD/MDSR totalizaram 66,3 mil DALY e ≈€1,1 mil milhões em custos societais (≈€30,8 milhões diretos). Discussão e conclusões. Os resultados demonstram que, em Portugal, a depressão é frequente, socialmente estruturada e heterogénea no tempo. A triangulação entre retrato populacional, síntese longitudinal e coorte nacional confere robustez interna à tipologia de quatro trajetórias e aos seus determinantes, e o estudo de carga/custos traduz esta heterogeneidade em métricas para decisão. Três implicações operacionais sobressaem: (i) monitorização breve e repetida de sintomas integrada nas revisões de doença crónica; (ii) reavaliação em janelas pré-definidas para deteção de não-resposta e ajuste terapêutico; (iii) escalonamento rápido para discussão multidisciplinar/referenciação quando o curso é alto-persistente ou em agravamento, em cuidados escalonados e colaborativos, com integração estruturada de atividade física e continuidade para pessoas com multimorbilidade. Em termos de equidade, recomenda-se auditoria de desempenho por sexo, idade, posição socioeconómica e multimorbilidade, para garantir que os ganhos não ampliam desigualdades. Entre as limitações, salienta-se o facto de se tratar de um estudo secundário da coorte nacional, pelo que o desenho do questionário deixa de fora dimensões que podem ser consideradas relevantes no estudo sobre saúde mental. De referir, por isso, o uso de escalas de sintomas (não diagnósticos clínicos), perdas de seguimento e autorrelato de comportamentos; contudo, decisões de medição (scores latentes), modelação transparente e sensibilidades pré-especificadas mitigam estes constrangimentos. Globalmente, a tese estabelece fundamentos empíricos e especificações técnicas para desenvolvimento e validação externa de ferramentas de estratificação utilizáveis em Portugal, e oferece um roteiro pragmático para implementar uma abordagem centrada em trajetórias nos cuidados de saúde.
- Identifying potential predictive and prognostic immune biomarkers in cutaneous melanomaPublication . Tomás, Ana; Sousa, Marta; Cabral, Maria de Guadalupe ; Pereira, PatríciaRESUMO: O melanoma cutâneo (MC) é a forma mais agressiva de cancro da pele e constitui um problema crescente de saúde pública a nível mundial. Apesar de representar menos de 5% dos casos de cancro da pele, o MC é responsável por mais de 60% das mortes associadas a este tipo de cancro devido ao seu elevado potencial metastático. Os avanços nas terapias alvo e nos inibidores de checkpoints imunológicos (ICIs) transformaram o seguimento clínico do doente com MC, proporcionando responstas duradouras em alguns doentes. No entanto, cerca de metade dos doentes com MC continua sem responder a estas terapias, e continuam a faltar biomarcadores fiáveis para prever a resposta à terapêutica. Paralelamente, as atuais estratégias de estratificação de risco são insuficientes, uma vez que um número significativo de doentes inicialmente classificados como de baixo risco acaba por apresentar recorrência e progressão da doença. Assim, existe uma necessidade urgente de biomarcadores de prognóstico e preditivos, bem como de uma melhor compreensão dos mecanismos relacionados com a agressividade do MC e com a resistência à terapêutica, de modo a possibilitar o desenvolvimento de novas terapias. Para abordar o primeiro desafio e identificar biomarcadores em circulação, baseados em características imunológicas, que permitam melhor estratificar os doentes com MC e a escolha da terapia mais adequada, analisámos por citometria de fluxo as células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) de 54 doentes com MC, não tratados previamente (maioritariamente em estádio III/IV). A comparação das frequências das diferentes populações de células imunológicas e da expressão de marcadores funcionais com dadores saudáveis revelou perfis globalmente comparáveis, mas destacou elevada variabilidade entre os doentes e alterações funcionais envolvendo marcadores de ativação das células T no MC avançado. A análise de sobrevivência identificou características imunológicas com forte potencial de prognóstico. Uma maior expressão de HLA-DR e CD69 em células T CD4+ em circulação, juntamente com uma menor frequência de células T CD8+ circulantes, esteve associada a um aumento da sobrevivência global (SG), sendo que o marcador HLA-DR também se correlacionou com uma sobrevivência livre de eventos (SLE) mais prolongada. Modelos de prognóstico, obtidos através da regressão de Cox, que combinaram estas variáveis imunológicas com uma pontuação de risco clínico composta, estratificaram com precisão os doentes em função da SG (89,5% de sensibilidade; 72,7% de especificidade; AUC = 0.872, p < 0.0001) e do risco de progressão ou recidiva (75% de sensibilidade; 71,4% de especificidade; AUC = 0.763, p = 0.001), superando os modelos baseados apenas em características clinicopatológicas. Estes resultados identificaram a expressão de HLA-DR e CD69 em células T CD4+ em circulação e a frequência de células T CD8+ circulantes como potenciais biomarcadores prognósticos em MC. Nos 43 doentes que posteriormente receberam tratamento com ICIs, a expressão basal de HLA-DR e CD69 em células T CD4+ circulantes também demostrou valor preditivo para o benefício clínico desta terapêutica. Um modelo de regressão logística preditivo que incorporou estes marcadores juntamente com variáveis clínicas demonstrou uma capacidade discriminatória moderada (AUC = 0.775, p = 0.0027), prevendo benefício clínico com 65,2% de sensibilidade e 88,9% de especificidade, e superando o modelo baseado apenas em variáveis clínicas. No entanto, a análise longitudinal mostrou utilidade limitada para monitorização em tempo real durante o tratamento. Estes resultados sugerem que a ativação sistémica de células T CD4+ pode constituir uma ferramenta para prever quais os doentes que beneficiarão dos ICIs antes de iniciarem o tratamento. O perfil de expressão génica tumoral de 26 doentes com MC identificou ainda uma assinatura distinta relacionada com o interferão-gama (IFN-γ), associada a uma SG e SLE mais longas. Embora a sinalização do IFN-γ já tenha sido amplamente associada à resposta a ICIs, o seu papel como fator de prognóstico independente do tratamento não está tão bem estabelecido. Assim, estes resultados consolidaram os perfis de expressão génica relacionados com o IFN-γ como uma ferramente de prognóstico no MC. Além disso, destacam a importância da ativação imunológica tanto a nível sistémico como a nível tumoral na determinação dos desfechos clínicos, reforçando o valor de integrar biomarcadores provenientes do sangue e do tecido para captar de forma mais completa as interações entre o tumor e o sistema imunológico. Para abordar o segundo desafio de clarificar os mecanismos de agressividade do MC e da resistência às terapêuticas, estabelecemos e caracterizámos uma nova linha celular de MC, MelT79, derivada de um doente inicialmente diagnosticado em estádio IB (baixo risco), mas que apresentou progressão da doença até ao estádio IV, apesar de múltiplas estratégias terapêuticas. A análise citogenética revelou um cariótipo complexo com um genoma altamente desequilibrado, incluindo alterações em genes-chave como CDKN2A/B, SPRED1, e B2M, relacionados com a melanomagénese e a resistência à terapêutica. Fenotipicamente, MelT79 demonstrou uma elevada heterogeneidade e plasticidade fenotípica, exibindo características tanto do fenótipo melanocítico/proliferativo, como do fenótipo indiferenciado/invasivo, com expressão intermédia de MITF. Além disso, as células MelT79 são completamente amelanóticas, sugerindo alterações na biogénese dos melanosomas ou no seu transporte, em concordância com a evidência de que as células invasivas de MC frequentemente aumentam a secreção de melanina para favorecer um fenótipo menos rígido, e mais elástico e invasivo. A nível proteico, a expressão de MITF mostrou-se altamente heterogénea, confirmando a coexistência de múltiplos estados fenotípicos nesta linha celular, promovendo a resistência às terapias e a progressão do MC. Desse modo, MelT79 apresentou sensibilidade moderada a inibidores de BRAF e MEK quando comparada com outras linhas celulares comerciais, e o perfil imunológico circulante do doente MelT79 esteve associado a mau prognóstico e a benefício limitado dos ICIs. Importa salientar que as células MelT79 apresentaram uma mutação rara, RET S649L, nunca previamente descrita em MC, mas que também foi identificada numa metástase anterior, possivelmente conferindo uma vantagem seletiva, e salientando esta mutação como potencial alvo terapêutico. Ao refletir tanto a trajetória clínica do doente como as principais características biológicas de progressão do MC, a linha MelT79 constitui uma valiosa adição ao repertório de modelos celulares de MC derivados de doentes. Em suma, os nossos resultados demonstram que a ativação imunológica sistémica, captada pela técnica simples de citometria de fluxo, e as assinaturas de expressão génica tumoral fornecem ferramentas com valor prognóstico e preditivo relevantes em MC. A identificação da expressão de HLA-DR e CD69 em células T CD4+ como biomarcadores candidatos reforça o papel central das células T CD4+ na imunidade antitumoral e na resposta aos ICIs. Além disso, o estabelecimento da linha celuar MelT79 fornece um modelo in vitro versátil para estudar mais profundamente a heterogeneidade do MC, as interações imunológicas, e a resistência às terapias. Por fim, mostramos que a imunidade sistémica e as características do tumor atuam em conjunto para moldar a progressão do MC, sugerindo que a adição da competência imunológica ao estádio e ao status mutacional pode permitir uma gestão mais personalizada dos doentes e melhorar os desfechos clínicos.
- Exploring breast cancer response prediction to neoadjuvant treatment through baseline FDG-PET/CT and MRI, FAP tumor expression and clinicopathological factorsPublication . Oliveira, Carla Filipa; Marques, Hugo Pinto; Cardoso, FátimaRESUMO: No carcinoma da mama precoce e localmente avançado, a quimioterapia neoadjuvante (QNA) é frequentemente utilizada para expandir as indicações cirúrgicas e melhorar a elegibilidade para cirurgia conservadora. A resposta patológica completa (pCR) à QNA é preditiva da evolução a longo prazo da doença. Contudo, como a QNA acarreta efeitos secundários significativos, uma seleção mais restritiva dos doentes que dela podem beneficiar evitaria toxicidades desnecessárias. Estudos prévios sugeriram, no carcinoma da mama, uma associação entre heterogeneidade metabólica tumoral na PET/CT [18F]FDG pré-terapêutica e resposta à QNA. Se houver a possibilidade de predizer a resposta à QNA com base em características extraídas da imagem do tumor primário da mama na PET/CT [18F]FDG de estadiamento, sem a necessidade de uma avaliação intermédia, a predição do prognóstico poderá ser antecipada, com consequente antecipação da decisão terapêutica. A heterogeneidade metabólica em PET/CT [18F]FDG reflecte a co-existência de diferentes taxas de consumo de glicose no mesmo microambiente tumoral. Um dos factores subjacentes a esta heterogeneidade metabólica poderá ser a presença de cancer associated fibroblasts (CAFs), cuja reprogramação metabólica com indução de glicose aeróbia gera metabolitos essenciais para a fosforilação oxidativa nas células tumorais, promovendo a tumorogénese. Embora não existam marcadores específicos de CAFs, há uma panóplia de marcadores que são comuns à maioria destes fibroblastos. Um desses marcadores é o fibroblast activation protein- (FAP), que é expresso em níveis insignificantes nos tecidos adultos normais, mas expresso em níveis elevados no estroma de vários tumores, incluindo no cancro da mama. Embora não seja consensual, a maioria dos estudos sugere um papel do FAP na progressão do cancro da mama. Curiosamente, foi demonstrada uma redução da expressão de FAP no estroma do carcinoma da mama em subtipos moleculares luminal-like, comparativamente aos subtipos human epidermal growth factor receptor 2 (HER2)-enriquecido e triplo negativo, tipicamente mais agressivos e que geralmente respondem melhor à QNA. A ressonância magnética (RM) é considerada o exame de referência para predição da resposta à terapêutica no cancro da mama, geralmente após um número fixo de ciclos de quimioterapia. Contudo, estudos recentes procuram investigar, também, a capacidade de predição da resposta ao tratamento neoadjuvante com base unicamente na RM basal (habitualmente utilizando as imagens da fase inicial pós-contraste da sequência dinâmica ponderada em T1), sem necessidade de avaliação interina. Alguns autores sugerem que assinaturas radiómicas com base na RM pré-tratamento podem estar associadas a resposta à QNA, mas os resultados não são consensuais. Com base nestes pressupostos, os principais objectivos desta tese foram: 1) analisar o papel da PET/CT [18F]FDG e da RM mamária pré-tratamento na predição da resposta à QNA; 2) avaliar a potencial associação entre a expressão de FAP no estroma de biópsias de carcinoma da mama e a ocorrência de pCR após QNA. Para avaliação do papel da PET/CT [18F]FDG na predição da resposta à QNA, foram incluídas doentes de sexo feminino com carcinoma da mama de tipo não especial (NST) submetidas a PET/CT [18F]FDG de estadiamento, QNA e cirurgia mamária na Fundação Champalimaud, num total de 168 doentes (170 tumores). As imagens PET/CT [18F]FDG do tumor primário e da axila metastizada (quando aplicável) foram segmentadas de acordo com um algoritmo de segmentação automática. Foram analisados vários parâmetros metabólicos extraídos das lesões segmentadas, reflectindo principalmente a intensidade de captação de [18F]FDG [por exemplo maximum standardized uptake value (SUVmax), mean standardized uptake value (SUVmean), median standardized uptake value (SUVmedian), peak standardized uptake value (SUVpeak)] e a heterogeneidade de captação do radiofármaco (por exemplo coeficiente de variação, desvio padrão, entropia e uniformidade). Os parâmetros metabólicos extraídos foram comparados nos grupos com e sem pCR utilizando o teste U de Mann-Whitney. Adicionalmente, foi feita uma subanálise na amostra de doentes com RM mamária pré-tratamento realizada na Fundação Champalimaud (assegurando assim as mesmas condições de aquisição das imagens analisadas), em que parâmetros de primeira ordem baseados na intensidade de sinal foram extraídos do tumor primário, utilizando um método semelhante ao aplicado na segmentação das imagens PET. As imagens utlizadas para segmentação foram as do primeiro minuto pós-gadolínio da sequência dinâmica ponderada em T1. Esta subanálise incluiu 102 doentes (103 tumores). Para cada um do total de 170 casos utilizados no estudo, foram recolhidos do processo clínico os seguintes parâmetros clinicopatológicos: idade no diagnóstico; menopausa/pós-menopausa; estadio clínico (cTcN); grau tumoral (1-2 vs 3); unifocalidade vs multifocalidade/multicentricidade do tumor primário; índice Ki67; receptores de estrogénio e de progesterona; score imuno-histoquímico (IHQ) de HER2. Para efeitos estatísticos, os tumores com score IHQ 0, 1+ ou 2+ não amplificado por hibridização in situ (ISH) foram considerados HER2 negativos e os tumores com IHQ score 3+ ou 2+ amplificado por ISH foram considerados HER2 positivos. Para cada uma das variáveis PET, RM e clinicopatológica analisada, foi feita uma análise receiver operating characteristic (ROC) para avaliar o respectivo poder discriminativo da resposta à QNA (pCR vs não-pCR). Posteriormente foi feita análise multivariada incluindo as características com valor preditivo significativo da pCR com base na área sob a curva ROC (AUC). Neste processo de selecção, de entre as variáveis altamente correlacionadas, apenas aquelas com maior AUC foram seleccionada para a análise multivariada. Finalmente, as variáveis seleccionadas foram utilizadas na regressão logística multivariada. Os principais resultados do estudo indicam que, embora pareça existir uma associação entre variáveis baseadas em PET/CT [18F]FDG e resposta à QNA em tumores HER2-negativos, traduzidos por captação de [18F]FDG mais intensa e mais heterogénea nos doentes que apresentaram pCR, a adição das variáveis baseadas em PET/CT [18F]FDG ou RM aos parâmetros clinicopatológicos não melhorou significativamente a predição de pCR. O status dos receptores de estrogénio, a expressão de HER2 e o grau tumoral mantiveram-se como os principais factores preditivos de pCR. Estes achados sugerem que a avaliação imagiológica basal, utilizando PET/CT [18F]FDG e RM, não oferece valor incremental significativo na predição de pCR em relação à apreciação clinicopatológica. Para avaliação adicional do papel da RM na predição da resposta à QNA, a amostra utilizada na subanálise do primeiro estudo foi alargada utilizando os mesmos critérios de inclusão, passando a incluir 202 doentes (203 tumores). As imagens RM do primeiro minuto pós-gadolínio da sequência ponderada em T1 foram utilizadas para segmentação semi-automática do tumor primário e da axila metastizada (quando aplicável), com optimização manual em cada um dos casos. Para além de características de primeira ordem, foram extraídos parâmetros de segunda ordem (textura). Contudo, de forma a evitar possíveis associações aleatórias entre variáveis baseadas na RM e resposta à QNA, em vez de utilizarmos todas as variáveis disponíveis na biblioteca PyRadiomics, optámos por fazer uma revisão da literatura para seleccionar as variáveis a serem analisadas. Esta revisão da literatura incluiu os artigos originais publicados nos últimos 5 anos, dos quais foram seleccionadas apenas as variáveis baseadas na RM (do primeiro minuto pós-gadolínio da sequência ponderada em T1) que contribuíram para predizer a resposta à QNA. Ao todo, 43 características (14 de primeira ordem e 29 de segunda ordem) foram seleccionadas para análise, tendo sido comparadas nos grupos com e sem pCR utilizando o teste U de Mann-Whitney. Foram poucas as características radiómicas de RM que conseguiram predizer a pCR à QNA no cancro da mama (apenas ¼ das características analisadas, todas elas de segunda ordem), pelo que a sua validade parece questionável. O facto de a maioria dos estudos revistos ter incluído centenas de características radiómicas de RM aumentou a probabilidade de serem encontradas associações estatísticas ao acaso. O nosso estudo mostrou que a associação entre as variáveis radiómicas de RM e a pCR varia consoante o subtipo tumoral (apenas uma variável esteve associada a pCR na amostra total, enquanto 11 variáveis estiveram associadas a pCR em pelo menos um dos subtipos analisados). Assim, um próximo passo deverá consistir na validação externa das características preditivas de pCR de acordo com o nosso estudo, tendo em conta cada subtipo tumoral, e a avaliação do seu impacto quando combinadas com as variáveis clinicopatológicas. Relativamente à análise da expressão de FAP no estroma tumoral, selecciou-se uma amostra de 30 doentes com carcinoma da mama NST em que foi documentada pCR na peça operatória (ypT0/Tis ypN0) e uma amostra de 30 de doentes com carcinoma da mama NST em que não ocorreu pCR. Todas estas doentes tinham realizado PET/CT [18F]FDG pré-tratamento. Destes 60 casos selecionados, foi recuperado o respectivo material de biópsia do carcinoma da mama e nele foi analisada a expressão de FAP. As lâminas foram avaliadas por uma patologista, cega para o resultado (pCR vs não-pCR) dos respectivos doentes. A avaliação da expressão de FAP foi semi-quantitativa, tendo sido definidos quatro scores (0, 1, 2 e 3): 0 (imunomarcação negativa ou fraca em <1% das células do estroma tumoral), 1+ (coloração focal em 1-10% das células do estroma tumoral), 2+ (positiva em 11-50% das células do estroma tumoral) e 3+ (positiva em 51-100% das células do estroma tumoral). Os scores 0 e 1+ foram considerados negativos e os 2+ e 3+ foram considerados positivos para a expressão de FAP. Utilizando uma classificação dicotómica para a expressão de FAP (negativa vs positiva), esta foi comparada através do teste exacto de Fisher com: a resposta patológica à QNA (pCR vs não-pCR); status de receptores de estrogéneo (negativos vs positivos); score IHQ de HER2 (score 0, 1+, or 2+ não amplificado por ISH vs score 2+ amplificado por ISH ou score 3+); grau de Nottingham (1-2 vs 3). A expressão de FAP (negativa vs positiva) foi também comparada com o índice Ki67 e com características baseadas na PET/CT [18F]FDG (SUVmax, SUVmedian, SUVmean, SUVpeak, desvio padrão e coeficiente de variação) utilizando o teste U de Mann-Whitney. O nosso estudo mostrou uma associação positiva entre a expressão de FAP e a ocorrência de pCR após QNA, indicando uma maior probabilidade de pCR nas doentes com expressão positiva de FAP na biópsia tumoral. Se estes resultados preliminares vierem a ser confirmados, a expressão de FAP pode vir a ter um papel relevante na antecipação do prognóstico e na personalização do tratamento. Não se encontrou nenhuma outra associação estatisticamente significativa entre a expressão de FAP e os restantes parâmetros IHQ analisados nem entre a expressão de FAP e as características de PET/CT [18F]FDG analisadas. Estes factos poderão ter resultado da pequena dimensão da amostra analisada, merecendo confirmação em estudos ulteriores com uma amostra mais alargada. Em suma, os trabalhos apresentados nesta tese investigaram a previsão de pCR após QNA no cancro da mama, utilizando dados de PET/CT [18F]FDG e RM pré-tratamento, juntamente com a expressão de FAPα no estroma tumoral. Os resultados indicam que características de primeira ordem em PET/CT [18F]FDG poderão estar associadas a pCR em tumores HER2-negativos, mas não se sobrepõem às características patológicas. Apenas uma minoria (aproximadamente ¼) das características de RM sugeridas na literatura como preditivas da resposta à QNA confirmaram ser preditivas no nosso estudo (todas elas de segunda ordem), sendo esta capacidade preditiva dependente do subtipo tumoral. Finalmente, a expressão elevada de FAPα no estroma tumoral mostrou estar associada a uma maior probabilidade de pCR. Recomenda-se, para futuro, que as pesquisas tenham em conta a uniformização dos protocolos de imagem e que a análise seja estratificada por subtipo tumoral, priorizando características de primeira ordem em PET/CT [18F]FDG e selecionando características de RM com comprovada capacidade preditiva. A validação futura da relação entre elevada expressão de FAPα e maior probabilidade de pCR após QNA deverá ser efectuada em estudos prospectivos maiores e será fundamental para que este biomarcador possa ser incluído em modelos preditivos da resposta à QNA no cancro da mama.
- Lysosome dysfunction and cellular senescence in Atherogenesis: is there a link?Publication . Lopes, Elizeth; Vieira, Otília; Marques, AndréRESUMO: A disfunção lisossomal e a senescência celular desempenham papéis fundamentais no desenvolvimento da aterosclerose. No entanto, os mecanismos moleculares subjacentes e a potencial ligação entre eles permanecem desconhecidos. Identificámos anteriormente uma nova família de lípidos oxidados, os hemiésteres de colesterol (ChEs), produtos finais da oxidação de ácidos gordos poliinsaturados em ésteres de colesterol (PUFA-CEs) no plasma e nos tecidos de pacientes com doenças cardiovasculares (DCV). Verificou-se que o hemiazelato de colesterol (ChA), o ChE mais prevalente no plasma e nas lesões ateroscleróticas, tem um impacto significativo na função lisossomal das células do musculo liso (CMLs), causando a paragem do ciclo celular (quiescência). No entanto, as CMLs tratadas com ChA nunca atingiram um estado senescente. Considerando essas informações, pretendíamos construir um modelo celular adequado para estudar a senescência prematura induzida por stress (SIPS) e o mau funcionamento dos lisossomas desencadeado pelas ChEs. Em primeiro lugar, procuramos desenvolver um modelo de senescência utilizando fibroblastos embrionários de ratinho (MEFs) e ChA como insulto patológico. Para estudar o papel da função lisossomal no desenvolvimento da senescência, utilizámos MEFs com dupla knockout (DKO) dos fatores de transcrição TFEB e TFE3, que regulam a função lisossomal e a autofagia, bem como a sobrevivência das células senescentes. Notavelmente, os fibroblastos wild type expostos ao ChA exibiram acumulação perinuclear e lisossomas aumentados cheios de lípidos neutros, mas não apresentaram sinais de senescência. Embora os resultados não tenham apoiado a nossa hipótese inicial de indução da SIPS, eles revelaram outras informações importantes, como a inibição da autofagia, provavelmente através da ativação do mTORC1, resultando em última instância na apoptose dos fibroblastos. No entanto, descobrimos que os fatores de transcrição TFEB/TFE3 são necessários para a internalização do ChA, levando a ausência de fenótipo nas células DKO. Além disso, a passagem em série de células MEF para induzir a senescência replicativa resultou principalmente na morte celular, em vez do estabelecimento de um fenótipo senescente estável. Estas limitações tornaram as células MEF inadequadas para os nossos objetivos experimentais. Em seguida, mudámos o nosso foco para as CMLs e um membro alternativo da família ChE, o hemiglutarato de colesterol (ChG), para desenvolver um modelo mais robusto de senescência. O ChG é o segundo ChE mais prevalente em lesões ateroscleróticas e, devido à sua estrutura química, é mais difícil de ser hidrolisado nos lisossomas comparativamente ao ChA. As nossas descobertas mostram que a exposição ao ChG prejudica a atividade lisossomal e induz a senescência, nomeadamente um aumento da enzima β-galactosidase associada à senescência, um marcador estabelecido de senescência que liga os dois processos. Essas células permanecem metabolicamente ativas, conforme demonstrado pela ativação de mTORC1/S6K, provavelmente levando a um aumento na secreção de moléculas do fenótipo secretório associado à senescência (SASP). Além disso, a exposição das CMLs a um fármaco lisomotrópico, a cloroquina, induziu resultados semelhantes aos da ChG, sugerindo uma ligação entre a disfunção lisossomal e a senescência. O nosso próximo passo foi investigar a dinâmica da senescência e da disfunção lisossomal em VSMCs tratadas com o ChG para determinar qual mecanismo ocorre primeiro. No geral, mostramos que o ChG é capaz de induzir disfunção lisossomal e SIPS num modelo murino de VSMC. Usando este modelo, no futuro, poderemos ser capazes de estabelecer se o direcionamento da disfunção lisossomal é uma via adequada para prevenir a senescência no contexto da aterosclerose.
- Unravelling the potential of extracellular vesicles as biomarkers of intraductal and cribriform prostate cancerPublication . Bernardino, Rui M.; Pinheiro, Luís; Matthiesen, Rune; Henrique, RuiRESUMO: O cancro da próstata é a segunda neoplasia maligna mais diagnosticada em homens em todo o mundo e uma das principais causas de mortalidade por cancro. Embora muitos casos sigam um curso indolente, outros progridem agressivamente, exigindo uma estratificação de risco mais precisa. Entre as variantes agressivas de cancro da próstata, o padrão cribriforme e o carcinoma intraductal têm surgido como marcadores prognósticos críticos. Estes subtipos morfológicos estão associados a instabilidade genómica, taxas mais elevadas de falência bioquímica e a maior potencial metastático. Apesar da sua importância clínica, o padrão cribriforme e o carcinoma intraductal são frequentemente subdiagnosticados devido às limitações das abordagens diagnósticas convencionais, incluindo biópsia prostática e ressonância magnética multiparamétrica. A vigilância ativa tem sido cada vez mais adotada para carcinoma da próstata de risco intermédiofavorável, particularmente no Grupo 2 [Gleason 7 (3+4)], suportada pelo reconhecimento de que nem todos os casos de risco intermédio progridem agressivamente. As diretrizes da European Urology indicam que a vigilância ativa não é apropriada para homens com padrão cribriforme e/ou padrão intraductal na biópsia prostática, sendo que estes doentes devem ser submetidos a terapêutica radical. A terapia focal também tem surgido como uma opção promissora para a doença localizada, oferecendo benefícios em eficácia e qualidade de vida. No entanto, a otimização dos métodos de seleção de doentes continua a ser fundamental. Esta tese de doutoramento pretende abordar estas lacunas críticas no iagnóstico e avaliação prognóstica destes padrões através de: 1. Avaliação das limitações da biópsia da próstata na deteção do padrão intraductal e padrão cribriforme. 2. Análise do impacto oncológico da não deteção destes padrões nos desfechos da doença, em particular na falência bioquímica e patologia adversa (estádio ≥ T3) na peça de prostatectomia radical. 3. Investigação das vesículas extracelulares urinárias como uma plataforma não invasiva e promissora de biomarcadores para a identificação destes padrões. 4. Avaliação do valor preditivo da razão PSA livre/total na deteção do padrão intraductal e cribriforme em casos onde eles estão presentes mas não foram detetados na biópsia (Falsos Negativos). 5. Determinação da associação entre os padrões cribriforme e intraductal e as características metastáticas na imagem PSMA-PET/CT, tanto em contextos de recorrência bioquímica quanto antes do tratamento com intuito curativo. Para alcançar estes objetivos, realizamos seis estudos que integram dados clínicos, patológicos, moleculares e de imagem. O Estudo 1 avaliou a sensibilidade e especificidade das biópsias sistemáticas e dirigidas por ressonância magnética na deteção do padrão intraductal e cribriforme, utilizando as peças de prostatectomia radical como referência. No Estudo 2, analisámos as implicações clínicas das biópsias falso-negativas (para estes padrões) e o impacto nos desfechos oncológicos, incluindo recorrência bioquímica e características patológicas adversas. O Estudo 3 centrou-se no perfil proteómico das vesículas extracelulares urinárias para identificar proteínas diferencialmente expressas associadas ao padrão intraductal e cribriforme. O Estudo 4 investigou se a razão PSA livre/total poderia servir como biomarcador para a deteção de casos de carcinoma intraductal ou cribriforme que não foram detetados corretamente na biópsia prostática. Os Estudos 5 e 6 analisam a associação entre a presença de padrão intraductal ou padrão cribriforme em peças de prostatectomia radical (Estudo 5) ou em biópsia prostática (Estudo 6) e os padrões metastáticos na imagem PSMA-PET/CT, em contextos de recorrência bioquímica e antes de tratamento com intuito curativo, respetivamente. No Estudo 1, verificámos que a biópsia prostática sistemática demonstrou sensibilidade limitada para a deteção do carcinoma intraductal e padrão cribriforme, com taxas de 44,1% e 42,4%, respetivamente, evidenciando os desafios na identificação destes padrões de alto risco. Mesmo as biópsias dirigidas por ressonância magnética ofereceram apenas melhorias marginais, reforçando a necessidade urgente de outras ferramentas diagnósticas. No Estudo 2, ao avaliar o impacto oncológico da não deteção destes padrões na biópsia da próstata, observamos que os doentes com doença não detetada apresentavam piores desfechos oncológicos, incluindo um aumento de cerca de duas vezes de patologia adversa (≥pT3) nas peças de prostatectomia radical. As biópsias falsonegativas estavam independentemente associadas a um risco aumentado de recorrência bioquímica, com um hazard ratio de 2,14. Além disso, num subconjunto de doentes considerados elegíveis para vigilância ativa, aqueles com biópsias falsas negativas para estes padrões tinham um risco quase quatro vezes maior de patologia adversa na peça de prostatectomia radical em comparação com os casos verdadeiramente negativos. No Estudo 3, a análise proteómica das vesículas extracelulares urinárias identificou 171 proteínas diferencialmente expressas entre os casos positivos e negativos (no que concerne a estes padrões), com S100A10 e PTGES3 (Prostaglandin E synthase 3) permanecendo significativamente desregulados após ajuste para o grau de Gleason. Além disso, TMBIM1 (Transmembrane Bax Inhibitor Motif Containing 1) foi identificado como um gene sobre-expresso em casos de com padrão cribriforme/carcinoma intraductal, sugerindo um papel potencial na sobrevivência das células tumorais e resistência à apoptose. A análise de enriquecimento funcional revelou uma redução significativa nas vias de resposta aos androgénios e uma forte ativação de marcadores de transição epitelial-mesenquimatosa em doentes com estes padrões, indicando maior capacidade de invasão e metastização. No Estudo 4, a razão PSA livre/total não demonstrou valor preditivo significativo na deteção do carcinoma intraductal e padrão cribriforme não diagnosticados correctamente na biópsia. No entanto, isto contrasta com um estudo prospetivo, conduzido fora do âmbito desta tese, envolvendo 137 doentes com recidiva bioquímica pós-prostatectomia radical e níveis de PSA inferiores a 1 ng/mL, onde verificámos que uma razão PSA livre/total ≥ 0,10 foi um preditor independente de positividade para mestástases no PSMA-PET/CT. No Estudo 5, analisámos a relação entre a histologia cribriforme nas peças de prostatectomia radical e os padrões metastáticos no PSMAPET/ CT em doentes com falência bioquímica após prostatectomia radical. Os nossos resultados mostraram que a presença de padrão cribriforme na peça operatória estava independentemente associada a uma maior probabilidade de metástases (OR: 2,17, p = 0,033) e demonstrou uma preferência três vezes superior para disseminação linfática em comparação com óssea/visceral (OR: 3,13, p = 0,037). No Estudo 6, explorámos a associação entre carcinoma intraductal na biópsia pré-tratamento com intuito curativo e os padrões de disseminação metastática no PSMA-PET/CT em doentes recém-diagnosticados com carcinoma da próstata. O carcinoma intraductal foi independentemente associado a uma maior carga metastática e a um padrão de disseminação predominantemente linfática. A presença de carcinoma intraductal na biópsia triplicou as probabilidades de metástases (OR: 3,03, p = 0,008) e foi um forte preditor de disseminação linfática (OR: 3,03, p = 0,01). Concluindo, nesta tese demonstrámos que a biópsia prostática falha na deteção destas morfologias agressivas em mais de 50% dos casos, e que a não deteção destes padrões está associada a desfechos oncológicos adversos. Além disso, 47% dos doentes elegíveis para vigilância ativa teriam tido resultados adversos se o carcinoma intraductal/padrão cribriforme tivesse sido negligenciado na biópsia. No contexto da PSMA-PET/CT, o padrão intraductal na biópsia, mas não o padrão cribriforme, foi um preditor significativo de metástases nos gânglios linfáticos, justificando a sua eventual utilização em doentes de risco intermédio com PSA >10. Finalmente, os perfis proteómicos das vesículas extracelulares urinárias sugerem que estas podem ser uma ferramenta valiosa para estratificação de risco, especialmente em casos com biópsia inconclusiva. Futuros estudos deverão centrar-se na validação de biomarcadores baseados em vesiculas extracelulares em coortes maiores e na exploração do seu papel na tomada de decisões clínicas, particularmente na otimização da seleção de doentes para vigilância ativa e terapia focal.
- Holmium:YAG laser lithotripsyPublication . Kronenberg, Peter ManuelThe subject of this thesis is holmium laser lithotripsy (Holmium:yttrium-aluminum-garnet). This thesis is presented in accordance with the current regulations of the cycle of studies leading to the degree of Doctor of Medicine at NOVA Medical School – Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Nova de Lisboa, Regulation No. 519/2015 published in Diário da República, 2nd series, No. 153, on August 7, 2015. This thesis is presented in the form of a compilation of already published scientific works as an alternative to the thesis, in accordance with articles 4 and 20 of the aforementioned regulation.
- Quando o Adolescente se torna adulto (experiências de transição de serviços de Saúde Mental em Portugal)Publication . Salgado, JoséRESUMO: Desde meados dos anos 80 do século passado, têm vindo a desenvolver-se em todo o mundo serviços de Psiquiatria que se diferenciaram na abordagem da doença psiquiátrica em pessoas no final da adolescência e início da idade adulta. Esta evolução tem acontecido com particular enfase nos países mais desenvolvidos e com sistemas de saúde orientados para a prestação de cuidados baseados na evidência, nomeadamente nas patologias de evolução prolongada, dado o seu começo habitual na infância e adolescência, com a faixa etária 16–18 anos a apresentar uma vulnerabilidade significativa. Outra razão para o desenvolvimento destes serviços assenta no facto da organização tradicional dos serviços de saúde mental criar lacunas na transição, acontecendo frequentemente que jovens acompanhados por serviços pediátricos podem não encontrar equivalente nos serviços de adultos, quebrando a continuidade dos cuidados, com ruturas no tratamento e consequente descompensação dos quadros clínicos, como demonstra a investigação desenvolvida em vários países. Muitos serviços de adultos, pela natureza específica do seu foco, podem ter dificuldades na abordagem de indivíduos à volta dos 18 anos, que não sendo já crianças, não são ainda iguais aos outros adultos, até mesmo nas características das doenças que apresentam. Também é muitas vezes apontada como justificação para a criação de serviços de transição o estabelecimento, na organização dos serviços de saúde mental, de fronteiras etárias rígidas, bem como a inexistência ou incumprimento de protocolos que permitam que a passagem de um serviço para outro se processe de forma menos disruptiva.Deste modo, reduzir-se-ia eventualmente o número de jovens que se “perdem” nesta transição, assim como o período de doença não tratada (DUP) e a morbilidade. A mais-valia das equipas e serviços de transição, para pessoas entre 14 e 25 anos, tem sido referenciada para várias áreas da Saúde, não apenas na doença mental. Tais resultados poderão ser fortalecidos com o desenvolvimento de modelos de transição, considerando dimensões como a autonomia, ocupação escolar e profissional, tempos livres e envolvimento com a comunidade. Neste contexto, é necessário colocar em perspetiva eventuais diferenças entre os processos habitualmente designados por ‘transferência’ e ‘transição’. A primeira consiste no encerramento de cuidados na Psiquiatria da Infância e Adolescência e início na Psiquiatria de Adultos, com escassa ou nenhuma comunicação, enquanto a segunda é um processo desenvolvido com propósitos terapêuticos, com partilha direta de informações e equipas dedicadas. A literatura evidencia que uma transição bem-sucedida nem sempre acontece na realidade, porque existem mudanças relevantes de paradigma no tipo de abordagem específico de serviços de Psiquiatria da Infância e Adolescência versus serviços de adultos, o que justifica um aprofundamento destas dimensões em contexto de investigação. Neste estudo, pretendeu-se identificar os principais fatores/determinantes presentes no processo de transição entre serviços de Psiquiatria da Infância e Adolescência e serviços de adultos, de modo a clarificar as dimensões mais importantes em serviços localizados em Portugal. Para tal, foram estudados jovens com idades compreendidas entre os 18-25 anos, seguidos numa unidade partilhada de adolescentes e jovens adultos (internamento e ambulatório), localizada num centro hospitalar psiquiátrico em Lisboa. Foram avaliadas as vivências de uma amostra de conveniência de jovens, assim como dos seus médicos assistentes (psiquiatras ou psiquiatra da infância e adolescências), com recurso a caracterização sociodemográfica e a métodos de análise qualitativa, com recurso a entrevistas semiestruturadas. O tamanho da amostra foi balizado pela Saturação (ponto da colheita de dados em que, no contexto de uma metodologia qualitativa, nenhuma informação nova emerge de uma nova entrevista). Os resultados obtidos parecem demonstrar que o processo de passagem de serviços de Psiquiatria da infância e adolescência para serviços de adultos não recebe a atenção necessária por parte dos médicos que nele intervêm, sendo mais frequente a passagem informal, que acontece por razões que dependem do cuidado posto pelo médico psiquiatra da infância e adolescência no processo e do interesse da família ou do doente em que não haja rutura na continuidade de cuidados. A passagem formal, que traria resultados mais consistentes, não acontece devido à inexistência de protocolos ou sequer de vias de comunicação minimamente fluidas entre os serviços, embora todos os médicos considerem que deveriam existir e reconhecerem os problemas que daí podem advir. Os resultados deste estudo sugerem fortemente que todos os médicos entrevistados consideram que existe uma dificuldade que urge resolver, muitos deles referindo que até ao momento da entrevista não tinham ainda refletido suficientemente sobre ela. Todos os médicos entrevistados consideram que deveria existir uma estratégia para a transição, sobretudo sob a forma de protocolos. Destes médicos, a maioria achou que seria vantajosa a existência de alguns serviços especializados a nível nacional.
- Hepatic encephalopathy and serum ammonia in critically ill patients with liver failurePublication . Cardoso, Filipe S.RESUMO: Os doentes críticos com falência hepática, seja falência hepática aguda (ALF) ou falência hepática aguda-em-crónica (ACLF), desenvolvem frequentemente encefalopatia hepática (HE). Neste contexto, a HE é um marcador da gravidade global da doença, tendo sido associada a piores resultados. A hiperamoniémia é uma característica da fisiopatologia da EH. Em doentes com ALF ou ACLF, o aumento dos níveis séricos de amónia foi associado a uma maior probabilidade de danos neurológicos. O edema cerebral pode desenvolver-se tanto em doentes com ALF como naqueles com ACLF. Além disso, nos doentes com ALF, o edema cerebral pode progredir para hipertensão intracraniana potencialmente fatal. Em doentes com ALF ou ACLF, a deteção precoce de complicações intracranianas decorrentes da HE grave à cabeceira da cama é habitualmente difícil. As técnicas de imagem cerebral podem apresentar baixa sensibilidade para diagnosticar edema cerebral numa fase inicial. Além disso, os procedimentos invasivos para medir a pressão intracraniana podem representar um risco elevado de complicações, nomeadamente hemorragia. Consequentemente, a melhor abordagem para monitorizar as complicações neurológicas nestes doentes permanece duvidosa. Considerando a falta de dados sobre como detetar o edema cerebral em doentes com FHA, avaliámos a utilidade potencial de dois estudos de imagem diferentes: (1) a medição do diâmetro da bainha do nervo óptico por ecografia à cabeceira da cama; e (2) a deteção de características de edema cerebral na tomografia computorizada cerebral padrão. Em doentes com falência hepática, apesar da ligação biológica entre a hiperamoniémia e a HE, controvérsia sobre como traduzir a medição dos níveis séricos de amónia em decisões clínicas significativas persiste. De facto, havia incerteza sobre como diminuir os níveis séricos de amónia de forma segura e eficaz para melhorar os resultados. Além disso, o papel prognóstico da amónia sérica tinha sido pouco explorado. Desta forma, estudámos como a circulação extracorporal, especificamente a terapêutica de substituição renal convencional, poderia diminuir os níveis séricos de amónia e beneficiar os resultados dos doentes com FHA. Além disso, derivou-se e validámos modelos prognósticos, incluindo a amónia sérica, para prever a sobrevivência livre de transplante a curto prazo, um para doentes com FHA e outro para doentes com ACLF.
- Diagnosis and prognosis disease biomarkers on critically ill patients with COVID-19 towards a precision medicine - a machine learning approachPublication . Araújo, Rúben; Bento, Luís; Calado, CecíliaRESUMO: A pandemia provocada pelo COVID-19 (do inglês COVID-19 – Coronavirus Disease 2019) serviu de aviso sobre a fragilidade inerente dos sistemas de saúde globais, tendo perturbado de forma significativa e global, equilíbrios sociais, económicos e estruturas organizacionais clínicas. Esta crise evidenciou a necessidade de desenvolver biomarcadores robustos, com utilidade diagnóstica e prognóstica, para melhor orientar decisões clínicas, especialmente em contextos de unidades de cuidados intensivos (do inglês ICUs – Intensive Care Units). Embora o foco principal desta tese tenha sido a COVID-19, foram exploradas estratégias de descoberta de biomarcadores em condições clínicas distintas, incluindo infeção, mortalidade e delirium, com o objetivo de avaliar o seu potencial de generalização em doentes com COVID-19 internados em unidades de cuidados intensivos, independentemente da patologia subjacente. O trabalho aqui apresentado baseou-se na utilização de técnicas ómicas, nomeadamente a espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier (do inglês FTIRS – Fourier-Transform Infrared Spectroscopy), permitindo caracterizar o estado bioquímico do organismo no momento da colheita da amostra, através da medição de sinais provenientes de proteínas, lípidos, metabolitos e, em menor grau, ácidos nucleicos. Foi também aplicada uma abordagem direcionada à caracterização proteómica de citocinas, com recurso a métodos estatísticos e de aprendizagem automática (do inglês ML – Machine Learning) para identificar biomarcadores clinicamente relevantes em doentes com COVID-19 internados em unidades de cuidados intensivos. A metodologia adoptada baseou-se numa robustez analítica, aplicabilidade prática e possibilidade de implementação futura em diferentes coortes, com ferramentas automáticas acessíveis a todos, incluindo indivíduos sem formação prévia em programação, matemática ou estatística. As duas principais linhas de investigação focaram-se na identificação de biomarcadores para (i) diagnóstico de infeção e (ii) prognóstico de mortalidade. O uso de espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier permitiu desenvolver modelos especializados na deteção de infeção, incluindo a discriminação entre doentes infectados e não infectados, diferenciação entre infeções bacterianas e fúngicas, identificação do local de infeção, classificação por Gram e, inclusivé, uma identificação preliminar ao nível da estirpe. Paralelamente, os perfis de citocinas obtidos por ensaios multiplex, especialmente quando explorados através do uso de rácios complexos, permitiram a discriminação do estado de infeção em doentes de unidades de cuidados intensivos—incluindo a diferenciação por etiologia, local de infeção e classificação de Gram—e o desenvolvimento de modelos preditivos de mortalidade, permitindo superar indicadores tradicionais de cuidados intensivos, como o APACHE II (do inglês – Acute Physiology and Chronic Health Evaluation II), SAPS II (do inglês – Simplified Acute Physiology Score II) e SOFA (do inglês – Sequential Organ Failure Assessment), bem como métricas simples baseadas em concentrações individuais de citocinas. Estes resultados reforçam o benefício em combinar técnicas metabolómicas e proteómicas como ferramentas complementares para melhorar simultaneamente a sensibilidade e a interpretação contextual de biomarcadores em cuidados intensivos. Objectivos secundários incluíram a comparação entre o soro e plasma para aplicações em espectroscopia de infravermelho por transformada de Fourier, identificação de biomarcadores associados ao delirium e desenvolvimento de uma plataforma digital para automatizar projectos de investigação biomédica. O soro e o plasma apresentaram perfis espectrais distintos mas complementares. O plasma pode oferecer vantagens em determinados contextos de investigação, dependendo dos objectivos analíticos. Por sua vez, o soro oferece maior estabilidade de sinal, razão pela qual foi usado ao longo da tese—pelas melhores propriedades de conservação a longo prazo e ausência de interferência causada por fatores de coagulação. A espectroscopia de infravermelho por transformada de Fourier foi ainda utilizada na identificação de potenciais biomarcadores de delirium em doentes com COVID-19 internados em unidades de cuidados intensivos, alcançando métricas de classificação elevadas numa população clinicamente complexa. Por fim, foi desenvolvida a ferramenta ArsHive para apoiar a investigação biomédica através de uma plataforma intuitiva e acessível, que integra preprocessamento de dados, normalização, análise multivariada e aprendizagem automática, produzindo resultados prontos para publicação. Estes contributos adicionais reforçam o potencial de translação dos principais resultados desta tese e com eles promover uma adopção mais abrangente de abordagens baseadas em tecnologias ómicas, por forma a responder tanto aos constrangimentos em investigação como às exigências da prática clínica.
- Unveiling insulin degrading enzyme as a new therapeutic target for parkinson’s diseasePublication . Sousa, Luís; Miranda, Hugo; Macedo, Maria; Oliveira, RitaSummary Parkinson's disease (PD) affects over 11 million people worldwide, yet ~90% of cases are sporadic with unclear aetiology. Although genetic factors contribute, they account for only a fraction of disease burden, pointing to environmental and metabolic influences. Type 2 diabetes mellitus (T2DM) increases PD risk by 30–40%, with early-onset diabetics showing a hazard ratio of 3.8. A defining pathological hallmark of PD is the misfolding and aggregation of α-synuclein (aSyn) into Lewy bodies, driving dopaminergic neuron loss in the substantia nigra pars compacta. The resulting striatal dopamine depletion produces the classical motor features of PD, including bradykinesia and tremor, alongside diverse non-motor symptoms. T2DM is a chronic metabolic disorder characterized by hyperglycaemia resulting from insulin resistance and progressive β-cell dysfunction. Insulin-degrading enzyme (IDE) plays a crucial role in glucose homeostasis by degrading 50-70% of circulating insulin in the liver, making it a key regulator of systemic insulin levels. IDE dysfunction contributes to the hyperinsulinaemia characteristic of T2DM progression. IDE has also been shown to have chaperone-like activity that can prevent aSyn aggregation, and inverse IDE–aSyn relationships have been reported in pancreatic tissue from diabetic patients and in IDE knockout mice. Given diabetes as a major PD risk factor, this thesis investigated whether similar dynamics occur in brain tissue and whether IDE dysfunction mechanistically links metabolic disease to neurodegeneration. Using Thy1-aSyn transgenic mice, we conducted 36-week longitudinal assessments integrating metabolic, behavioural and regional brain biochemical analyses under normal chow (NCD) or high-fat diet (HFD). Transgenic mice appeared metabolically protected at baseline, with lower body weight and glucose levels, but showed disproportionate vulnerability under dietary challenge, revealing latent fragility. HFD accelerated PD phenotypes with temporal specificity: spatial working memory deficits arose 12 weeks earlier (24 vs 36 weeks) and motor impairments 4 weeks sooner with greater severity. Regionally, HFD selectively elevated midbrain aSyn, the site of dopaminergic degeneration, while sparing cortex, cerebellum and hippocampus. IDE responses were region-dependent, with the midbrain showing a twofold upregulation suggestive of compensation, diverging from peripheral inverse IDE–aSyn patterns. To establish IDE’s role, we characterised IDE knockout mice across 25 weeks. Sex stratification revealed marked differences. Male knockouts developed early glucose intolerance with paradoxical insulin hypersensitivity that normalised, while females maintained metabolically stable on normal chow but showed latent vulnerability under dietary stress. Behaviourally, male knockouts displayed pole test motor impairments independent of metabolic challenge, establishing IDE deficiency as a direct neurological risk factor. Females, exhibited subtler, diet-sensitive changes. Intriguingly, IDE loss also protected against specific HFD-induced cognitive and motor deficits, highlighting context-dependent functions. Brain aSyn levels were unchanged, suggesting effects independent of gross protein accumulation. To quantify motor dysfunction progression and phenotypic convergence, we performed high-resolution gait analysis across 86 locomotor parameters. In Thy1-aSyn mice, temporal progression revealed non-linear motor decline, with coordination parameters deteriorating by more than an order of magnitude between 20-36 weeks. Unexpectedly, HFD produced divergent rather than accelerated phenotypes, reprogramming locomotor patterns with opposite directional changes depending on age-diet combinations. IDE knockout mice exhibited distinct locomotor dysfunction with pronounced temporal and spatial coordination deficits under standard conditions that were paradoxically normalized under metabolic stress. Machine learning classifiers achieved 78-83% accuracy for early pathology detection and 96% for advanced disease stages. Analysis indicated qualitative locomotor reorganisation rather than simple deterioration, with mediolateral positioning variability, temporal coordination deficits, and spatial control disruption emerging as key discriminative features across disease models. Cross-cohort classification demonstrated notable phenotypic convergence: IDE knockout mice showed 72% directional alignment with PD-like gait signatures in feature-based analysis, while 15-19% of individual locomotor events were classified as transgenic-like. This convergence supports the concept that distinct molecular pathologies feed into shared downstream motor control vulnerabilities. Overall, this work reframes metabolic dysfunction from passive PD comorbidity to active disease modifier. The finding that metabolic stress accelerates rather than merely exacerbates pathology, combined with IDE's emergence as a molecular nexus linking metabolism to neurodegeneration, identifies novel therapeutic opportunities. These results support precision medicine strategies that consider sex, genetic architecture, metabolic status, sex, and disease stage when designing disease-modifying interventions for ageing populations.