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Publicação
Optimization of IgG Display in S. cerevisiae
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Orientador(es)
Resumo(s)
Yeast Display é uma tecnologia com grande aplicação na identificação e isolamento de anticorpos com propriedades específicas e desejáveis, assim como na engenharia e maturação de afinidade de anticorpos. A Bayer desenvolveu um sistema de display de IgGs em S. cerevisiae, e esta tese descreve o trabalho realizado na otimização e validação do mesmo, o qual foi realizado em duas partes distintas: a primeira parte teve como objectivo a otimização da expressão e display dos IgGs, e a segunda parte a análise da translocação dos IgGs dentro da célula.
Neste trabalho de investigação, foram testadas diferentes condições de expressão e avaliados os níveis de espressão das cadeias leve e pesada através da técnica de citometra de fluxo. Os resultados revelaram uma discrepância significativa em relação aos níveis de expressão das duas cadeias de anticorpo, em que apenas 30% da população expressou a cadeia pesada enquanto que a cadeia leve foi expressa em toda a população. Para além disso, e devido à ausencia de ligação específica entre os anticorpos e respectivo antigénio, não foi possível demonstrar a ligacao entre genótipo e fenótipo.
Na segunda parte deste trabalho, foram realizadas experiências de fracionamento de forma a determinar a localização subcelular das cadeias pesada e leve dos anticorpos expressos. Ambas as cadeias foram detetadas nas frações da membrana celular e citosólica, mas apenas a cadeia leve foi detetada na parede celular, indicando que o sistema de display não permitiu uma translocação bem succedida da cadeia pesada para a parede celular, resultando por conseguinte na impossibilidade de occorrer o display correto de IgGs completos. Para além disso, a detecção das cadeias de anticorpos em diferentes frações celulares indicou que diferentes vias secretoras podem ter estado envolvidas durante o direcionamento das cadeias leves e pesadas para a parede celular. Os resultados também demostraram que após a expressão de diferentes anticorpos, as cadeias leve e pesada foram detetadas em vários fragmentos proteicos de diferentes pesos moleculares, sugerindo a ocorrência de modificações pós-transducionais indesejadas e incorretas.
Em resumo, esta tese foi desenvolvida com o objetivo de otimizar a expressão do sistema de display de IgGs em leveduras assim como abordar os diferentes factores que possam estar relacionados com o insucesso deste sistema de display. O conhecimento adquirido durante este trabalho será certamente útil para futuros projectos da Bayer.
Descrição
Palavras-chave
Yeast display full-length IgG expression secretory pathway