Reconstituição hemato-imunológica após o transplante de células estaminais hematopoiéticas: recuperação da policlonalidade dos linfócitos T e B da funcionalidade das células

Abstract

RESUMO: O transplante de células estaminais hematopoiéticas (TCE) é um processo terapêutico usado no tratamento de doenças genéticas e malignas de modo a reconstituir uma hematopoiese normal e aumentar respostas antitumorais. O TCE é feito num contexto autólogo (autoTCE) de forma a recuperar a função da medula óssea após a utilização de terapia antitumoral de alta intensidade. Já o TCE alogénico (aloTCE) envolve sempre um condicionamento inicial mieloablativo, cito-redutor e imunossupressor que permite a aceitação do enxerto e simultaneamente, se for o caso, o controlo de doença tumoral. A recuperação pós-transplante envolve uma regeneração total da hematopoiese, desde a recolonização pelas células do enxerto dos nichos estaminais da medula óssea, ao desenvolvimento, maturação e diferenciação efetora das diversas linhagens celulares sanguíneas e imunológicas. A regeneração é progressiva, mas prolongada, e neste período os doentes apresentam-se severamente imunocomprometidos devido à imaturidade funcional e à restrição da diversidade estrutural dos repertórios linfocitários. No aloTCE, o processo é ainda mais dificultado com a profilaxia e/ou as complicações imunológicas derivam da aloreatividade. Este trabalho teve como objetivo fazer uma avaliação da reconstituição hematoimunológica após o autoTCE e aloTCE. Pretendeu-se, com uma análise abrangente a todos os compartimentos celulares periféricos com atividade imunológica, relacionar e integrar a dinâmica dos processos celulares observados, com os fatores clínicos do transplante e os mecanismos regulatórios da ontogenia hematopoiética e da diferenciação imunológica. Começou-se por estabelecer uma análise da consolidação da recuperação mieloide, nos grupos de doentes com autoTCE e aloTCE, com a avaliação da granulopoiese e monopoiese após o arranque hematológico. Nestas séries de doentes, a recuperação e consolidação da granulopoiese para valores no intervalo normal mostrou-se dependente das caraterísticas do enxerto. Alguns transplantes alogénicos usaram enxertos de medula óssea (MO) com uma dosagem significativamente inferior de células CD34+ comparativamente às colheitas de células estaminais mobilizadas para o sangue periférico (PBSCs). Os doentes com enxerto de MO apresentaram uma capacidade menor de recompor uma granulopoiese com contagens normais de neutrófilos aos 3, aos 6 e também aos 12 meses de evolução. A reconstituição da linfopoiese revelou dinâmicas muito diferentes para as populações e subpopulações de células NK, linfócitos B e T CD4+ e CD8+ e a cinética da recuperação e maturação de cada compartimento celular foi normalmente superior nos transplantes autólogos em relação aos alogénicos. A recuperação das células NK nos doentes com enxerto alogénico foi caraterizada por uma expansão inicial das frações celulares imaturas CD56++CD16- e CD56++CD16+. No entanto, estes doentes apresentaram um arresto da maturação do compartimento de células NK. Observou-se uma recuperação lenta das células maturas CD56dimCD16+ e níveis muito baixos da população de células NK CD56-CD16+ terminalmente diferenciadas em todos os pontos de análise. Já os doentes com transplante autólogo não apresentaram uma acumulação inicial tão extensa das células imaturas CD56++, e a meio do período da análise, as células NK maturas CD56dimCD16+ apresentaram contagens no intervalo normal. O processo de recuperação e desenvolvimento do compartimento celular NK após o transplante deverá ser muito provavelmente determinado pelos níveis de citocinas homeostáticas como a IL-15, e também, pelos níveis de células produtoras de citocinas modeladoras do desenvolvimento celular como a IL-2. De facto, neste trabalho, a evolução da recuperação e maturação das células NK foi correlacionada com a dimensão que os compartimentos de células T CD4+ e CD8+ apresentam nas fases iniciais da evolução dos transplantes. Os transplantes com contagens celulares T superiores apresentam uma expansão limitada de células imaturas CD56++ e uma maior capacidade de maturação do compartimento NK. As células T CD8+ e em especial as subpopulações de memória são particularmente sensíveis à IL-15. Os transplantes autólogos apresentam níveis iniciais mais elevados de células T comparativamente ao transplantes alogénicos provavelmente devido à ausência de um condicionamento imunossupressor presente nos segundos transplantes. Desta forma, nos transplantes autólogos e também nos doentes com transplante alogénico que fizeram uma recuperação inicial forte dos compartimentos de células T, a IL-15 disponível deverá ter sido utilizada em larga medida pela população maioritária de células T CD8+. A disponibilidade da apresentação desta citocina às células CD56++ é então limitada o que poderá justificar a expansão moderada destas células observada nestes grupos de doentes. Por outro lado, os níveis mais elevados de células T CD4+ nestes grupos possibilitam uma maior produção de IL-2, que é fundamental para o processo de maturação das células NK. Foi avaliada a diversidade genética dos genes dos recetores de células NK com domínios Ig (KIR) e foi avaliada a expressão genética do repertório de recetores das células NK no pós-transplante. A diversidade e a organização do cluster de genes KIR presente na população portuguesa está relacionada com encontrada na população caucasiana europeia. Nestas populações existe um balanceamento entre os repertórios de genes inibitórios e de ativação que resulta numa maior frequência de indivíduos com um genótipo constituído pelo haplótipos KIR A/B. A distribuição de genes KIR no transplante é determinada pela frequência dos genes KIR na população e o repertório de genes alocado no enxerto alogénico tem vindo a ser relacionado com a evolução clínica em alguns transplantes. O efeito aloreativo derivado da incompatibilidade do repertório KIR alocado e os ligandos do recetor parece ser determinante pelo menos no controlo da doença residual mínima derivada das leucemias mieloides. As interações do sistema de recetores KIR e de ligandos do HLA classe I foram avaliados nos transplantes alogénicos com dadores com diferentes graus de proximidade genética. Observou-se uma distribuição de interações KIR do dador – ligando do recetor independente da proximidade genética do par-dador recetor devida a uma segregação independente dos sistemas genéticos KIR e HLA, mas também em certa medida porque os vários painéis de dadores apresentam frequências genéticas KIR semelhantes. Foi verificada também uma expressão aleatória dos genes KIR, não dependente da presença dos ligandos HLA e no contexto alogénico foi detetado um repertório de transcritos quimérico que vai progressivamente evoluindo para o genótipo do repertório estrutural NK do dador, o que indicia uma regulação estocástica dos genes germinais. A reconstituição do compartimento linfocitário B é marcada por uma expansão de células transicionais imaturas e um atraso no processo de maturação. A análise de fatores como os sjKRECs indicadores da atividade linfopoiética B da medula óssea, a estimativa do histórico de divisões celulares e a diversidade estrutural do repertório da cadeia pesada das imunoglobulinas IGH, sugere que a recuperação celular B deverá ser estabelecida principalmente por uma neogénese celular derivada da medula óssea, enquanto os fatores homeostáticos das células B deverão promover uma sobrevivência celular, mas não proliferações expansivas. Nesta análise, verificou-se ainda que a maturação das células B, ao fim de um ano de evolução está relacionada com os níveis do primeiro semestre de sjKRECs e com a recuperação de células T CD4+. A recuperação das subpopulações T CD4+ e CD8+ é um processo imperfeito que é estabelecido em larga medida pela diferente sensibilidade de diferentes subpopulações celulares aos níveis elevados das citocinas homeostáticas do póstransplante. A recuparação da linfopenia CD4+ é mais condicionada, pois provavelmente exige intermediários celulares inibidos nas condições do póstransplante, pelo que, a reconstituição destas células parece ser feita quase em exclusivo por renovação tímica. A deficiente recuparação deste compartimento celular, que apresenta funções reguladoras centrais é condicionadora da maturação de outros compartimentos linfocitários incluindo o B e o NK. Quanto ao compartimento T CD8+ apresenta-se expandido com um repertório estrutural limitado e sinais de anergia e senescência. Estes indicadores sugerem que estas células, em particular as subpopulações T CD8+ maturas de memória, são alvo de proliferações sistémicas derivadas dos níveis elevados de citocinas homeostática a que são altamente sensiveis Em conjunto, os dados obtidos neste trabalho, estabelecem os processos de regeneração hematopoiética e reconstituição imunológica, apontando alguns fatores de condicionamento e potenciais marcadores de evolução clínica.

ABSTRACT: Hematopoietic stem cell transplantation is a therapy for treatment of genetic diseases and some malignancies by fixing haematopoiesis damages or boost antitumor immune responses. Autologous grafts are used to recover severe bone marrow depleted cancer patients after high-dose chemotherapy. Allogeneic transplantation uses a myeloablative conditioning that is immunosuppressive allowing engraftment and, if necessary, provides tumour control. Post-transplant recovery includes a complete regeneration of hematopoiesis with recolonization by graft of hematopoietic stem cell niches and a progressive ontogeny settlement for all blood cell lineages. This is however; a time-delayed process on which patients’ immune status is severely compromised due to immaturity and skewing of strutural diversity of lymphocytes repertoires. Progress of allogeneic transplant patients is even more unsettled due to alloreactivity prophylaxis and related immune complications. This study aims to evaluate the hemato-immunological reconstitution after autologous and allogeneic stem cell transplantation. It was established an analysis extended to several peripheral cellular immunological effectors, in order to correlate the recovery dynamics with transplant related factors and regulatory mechanisms of cell ontogeny and immunological differentiation. It is well established that the engraftment kinetics is highly conditioned by the graft stem cell dose. In this analysis, we focused our interest in the assessment of factors affecting the consolidation of myelopoiesis after transplantation by evaluating the midterm recovery of granulopoiesis and monopoiesis. Some of the transplants of the allogeneic series used a bone marrow (BM) graft with a significantly lower CD34+ cell dosage when compared with peripheral blood mobilized stem cell grafts (PBSCs). During the time-line of the analysis a higher proportion of patients with a BM transplant showed neutrophils absolute counts beneath the normal range. Consequently, the graft type and stem cell dosage seem to be a factor affecting not the initial engraftment kinetics but also the mid-term consolidation of the myeloid recovery. Each distinct lymphocyte cell type and subtype presented a specific reconstitution dynamic and the overall recovery kinetics of cellular levels and even maturation rate was found higher in autologous transplantation than in the allogeneic settings. Allogeneic transplant patients showed an early expansion of immature CD56++CD16- and CD56++CD16+ NK cell subsets. However, the maturation of NK cell compartment was found severely compromised. These patients presented a slow recovery of mature cytotoxic CD56dimCD16+ NK cell counts and levels of terminally differentiated CD56- CD16+ cell were depleted at all time points of the analysis. The NK cell compartment of autologous transplants showed a different recovery and maturation rate. These patients showed median immature CD56++ cell levels in normal range since the earliest evaluation at 3 months and also presented a better maturation rate. By the second semester after transplant, mature CD56dimCD16+ cell counts reached the lower boundary of normal range and also terminally differentiated CD56-CD16+ cells gone normal in the analysis time line. The reconstitution of the NK cell compartment in the different transplant settings is likely driven by a different exposure of NK cell subsets to homeostatic cytokines such as IL-15 and others such as IL-2. Furthermore, according to the data here described, it is a process highly conditioned by post-transplant CD4+ T cell levels and to a lesser extend with levels of CD8+ T cells. In a low T cell posttransplant condition, as seen in allo-HSCT patients, a large ratio of circulating NK cells were the immature CD56++. Auto-HSCT patients, with higher T cell levels, showed an enhanced NK cell development with no accumulation of immature subsets. It is possible that an effective consumption of homeostatic cytokines by an early dominant CD8+ T cell population determines a limited availability to other sensitive cells such as immature NK cells. Additionally, and while other regulatory mechanisms cannot be excluded, the observed enhancement of NK cells maturation with high levels of CD4+ T cells, is most probably a result of endogenous T cell derived IL-2; that acting through the high-affinity IL-2 receptor of CD56++ NK cells induce their maturation into CD56++ cells with cytoxicity competence. This is a process that is probably severely conditioned by the immunosuppressive regiments of allogeneic transplantation. It was also established the KIR genotypic diversity in Portuguese, the allocation of KIR genes and genetic expression after transplantation. The diversity of KIR gene cluster was evaluated in Portuguese and the genotypic profiles observed were found related to the ones covered in European neighbouring populations with a balance between the activation and inhibitory KIR genes repertoire. These gene frequencies determine the KIR repertoire allocated after stem cell transplantation, which was associated with the allogeneic post-transplant outcome. It has been hypothesized that donor-derived alloreactive NK cells target recipient hematopoietic cells resulting in an antileukemia effect and a lower incidence of graft rejection. However, those effects depend on multiple factors, including disease type, presence of T cells, immunosuppressants and the repertoires of allocated KIR genes and recipient HLA ligands. Although nonuniformly demonstrated, the capture of NK cell alloreactivity is probably shaped by a KIR ligand incompatibility either in the setting of a HLA class I mismatched transplant, or in the presence of a donor KIR loci for which there is no recipient ligand. We evaluated donor-KIR/recipient-ligand interactions in transplants with related donors and unrelated donors found in a local registry or from abroad. A significant fraction of these transplants had all three ligands of inhibitory receptors, and therefore, in theory were not prone to NK mediated alloreactivity. The distribution of KIR alloreactive interactions however, was found independent of the donor-recipient genetic proximity, almost certainly due to different gene segregation and a comparable KIR frequencies in the donor pools. KIR gene expression seems to be established mainly by stochastic regulation of germinal genes and not dependent on HLA ligand presence. Allogeneic transplants showed a chimeric KIR repertoire that was gradually replaced by a donor derived genotype. B cell compartment showed a distinct expansion of immature transitional cells and a maturation arrest. Results from sjKRECs quantifications indicates a recovery of B cell absolute counts mainly by bone marrow neogenesis. Analysis of cell divisions estimates and IGH repertoire diversity suggests that B cell homeostatic factors promote cell survival but not expansive proliferations. Subsequent recovery of mature and memory B cells was found correlated with early sjKRECs high levels and T CD4+ cell recovery. Within this analysis period, CD4+ and CD8+ T cell recovery was found highly deficient. It is modulated by cell sensitivity to post-transplant high levels of homeostatic cytokines and thymic activity. Homeostatic control of CD4+ lymphopenia probably requires a cellular intermediate, not readily available, making recovery almost completely dependent on thymic renewal. T CD8+ cell compartment was found highly disproportional with a skewed repertoire and signs of anergy and senescence. These are signs of systemic cell proliferations made by mature T CD8+ due to high sensitivity to increased homeostatic cytokines levels. Altogether, the data obtained in this study helps to establish the dynamics of hematological regeneration and immunological reconstitution, presenting some efficiency related factors and potential tools for monitoring transplant outcome.