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Publicação
Testing the role of asymmetric migratory behaviors found in a novel population of mesendodermal cells
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Autores
Orientador(es)
Resumo(s)
Abstract
During vertebrate development, symmetry breaking occurs in the left-right (LR) organizer (LRO).
The transfer of asymmetric molecular information to the lateral plate mesoderm is essential for
the precise patterning of asymmetric internal organs, such as the heart. However, it is also
necessary to maintain symmetry at the somite level for correct musculature and vertebrae
specification. In this study, we investigated the effects of LR signals on the behavior of zebrafish
somite cell precursors.
Here, we demonstrate how LR signals affect the behavior of zebrafish somite cell precursors. We
describe a population of cells in the vicinity of the LRO, named Non-KV Sox17:GFP+ Tailbud Cells
(NKSTCs), which migrate anteriorly and contribute to future somites. We showed that NKSTCs
originate in a cluster of cells aligned with the midline, posterior to the LRO, and leave that cluster
in an LR alternating manner, primarily from the left side. Fate mapping revealed that more
NKSTCs integrated into somites on the left side of the embryo. To investigate the role of
asymmetric cues from the LRO, we used dand5-/- mutant embryos and found that NKSTCs no
longer displayed asymmetric patterns. Cell exit from the posterior cluster became bilaterally
synchronous in dand5-/- embryos, revealing a new link between somite specification and Dand5
function. Moreover, we observed compromised anterior movement and reduced myoD
expression in the absence of the KV, indicating its role in tailbud cell movement and somite
specification. Our findings demonstrate the asymmetric behavior of somite precursor cells in
response to LR signals in vivo, which requires Dand5, and suggest an additional role for the KV
in tailbud cell movement and somite specification.
Additionally, using single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH), we quantified the
number of dand5 mRNA transcripts in 3D in the KV over time. We found that dand5 asymmetry
is already established at 6 ss, which is one hour earlier than previously reported by less sensitive
methods, and primarily occurs on the anterior side of the KV.
Overall, our findings demonstrate the asymmetric behavior of somite precursor cells in response
to LR signals in vivo, which requires Dand5, and suggest an additional role for the KV in tailbud
cell movement and somite specification. This study provides new insights into dand5 asymmetric
expression in zebrafish and sets the foundation for studying the involvement of other genes of
the LR cascade in this context. Our results have implications for understanding the role of
asymmetric cues in the formation of symmetric structures and provide insights into the
mechanisms underlying embryonic development.
Resumo Externamente, o corpo dos vertebrados é simétrico bilateralmente, no entanto, órgãos como o coração, intestino, pâncreas e fígado, pulmões e a vasculatura apresentam uma assimetria relativamente ao eixo Esquerda-Direita (ED), no que diz respeito ao seu posicionamento e/ou morfologia, numa disposição conservada denominada de situs solitus. O estabelecimento do eixo ED ocorre durante a embriogénese num processo coordenado após o estabelecimento dos eixos Antero-Posterior (AP) e Dorso-Ventral (DV). Esta assimetria é estabelecida durante o desenvolvimento embrionário por meio de um processo altamente regulado que envolve o organizador esquerda-direita (OED). O OED é responsável pela quebra da simetria bilateral através de um fluxo de fluido assimétrico que é gerado por cílios móveis. Este fluxo assimétrico leva a uma diminuição na expressão do mRNA de Dand5, um potente inibidor de sinalização Nodal, no lado esquerdo do OED, o que permite que Nodal, uma proteína envolvida no estabelecimento e transdução da assimetria ED, persista apenas no lado esquerdo da placa mesodérmica lateral (PML). Desta forma, uma cascata de eventos de expressão genética é desencadeada que resultam no desenvolvimento de órgãos internos com assimetria ED. No peixe-zebra, o OED é chamado de Vesícula de Kupffer (VK), esta é uma estrutura esférica e monociliada dentro da qual está presente um fluído e que se desenvolve durante os primeiros estadios de segmentação no final posterior da notocorda. A VK é derivada de um agregado de células superficiais localizadas perto do escudo embrionário, conhecidas como Células Percursoras Dorsais (CPD). As CPDs formam um padrão de roseta plana e circular, que depois coalesce numa estrutura tridimensional com uma cavidade central preenchida com fluido. À medida que a VK se forma, o influxo de fluido e a ciliogénese coincidem, resultando na expansão do lúmen e de cada célula da VK origina um único cílio que se estende para o lúmen. Subsequentemente, a VK passa por uma remodelação estrutural ao longo do eixo AP, levando a uma distribuição assimétrica das células ciliadas. Este processo depende de uma complexa interação de vários fatores, incluindo rearranjos no citoesqueleto induzidos pela notocorda, acúmulo de matriz extracelular, a função da Rho quinase Rock2b, Miosina não-muscular II e forças mecânicas de arrasto sobre a VK provocadas pelo movimento das células da cauda. A expressão do gene dand5 na VK é inicialmente simétrica, no entanto, no estadio de 8 sómitos (ss), a sua expressão passa a ser assimétrica, estando mais expresso no lado direito, num processo que é dependente do fluxo assimétrico no sentido anti-horário. O fluxo é gerado pelos cílios móveis e detetado pelo complexo de policistinas Pkd1l1 e Pkd2, no entanto o exato mecanismo de deteção do fluxo ainda não é completamente conhecido. Todavia, recentes descobertas sugerem que o Bicc1 tem um papel importante na desestabilização e inibição da tradução de dand5, tanto em ratos quanto em sapos, no lado esquerdo do OED, de uma maneira que é dependente do fluxo. Esse processo envolve a ação conjunta de Dicer1 e Pkd2, embora ainda não esteja claro se Bicc1 e Dicer cooperam na regulação de microRNAs para mediar a diminuição de dand5. Além disso, o mecanismo preciso pelo qual o Bicc1 interage com a região 3'-UTR de dand5 no peixe-zebra ainda não é conhecido, portanto, mais estudos são necessários.´ O gene nodal do peixe-zebra southpaw (spaw) desempenha um papel crucial no estabelecimento e transdução da assimetria ED. Inicialmente, spaw é expresso bilateralmente num padrão simétrico nas células adjacentes à VK por volta dos 4-6 ss. Por volta dos 10-12 ss, a expressão de spaw torna-se assimétrica no lado esquerdo da PML devido à remoção da inibição Dand5-Southpaw. Tal mecanismo permite que Spaw induza a expressão de seu mRNA, que subsequentemente se espalha da região posterior para a anterior do lado esquerdo da PML até aos 22 ss. O confinamento de Spaw no lado esquerdo é alcançado por meio de diferentes fatores secretados da família TGF-β. Lefty1 fornece uma barreira na linha média, Lefty2 cria uma barreira anterior no campo cardíaco esquerdo e a sinalização BMP forma uma barreira posterior. Juntos, estes processos coordenam o estabelecimento e a manutenção da assimetria ED no peixe-zebra que se traduz numa organogénese assimétrica posteriormente. Tão crucial como a quebra da simetria durante o desenvolvimento embrionário, é manter a simetria em estruturas como os sómitos que são a base para a musculatura simétrica, vertebras e inervação. Os sómitos formam-se de forma periódica e simétrica a partir da mesoderme pre somítica que não é segmentada num processo chamado de somitogénese. Este processo ocorre por meio de um mecanismo de clock de segmentação e frente de onda. O comprimento de cada somito é regulado por uma combinação do período do clock e da velocidade da frente de onda, regulado por gradientes morfogénicos de FGF, Wnt e ácido retinóico (RA). Embora a via de padronização ED instrua o desenvolvimento embrionário para a formação de padrões assimétricos, existem pistas moleculares compartilhadas para formar estruturas tanto simétricas quanto assimétricas. Nomeadamente, é sugerido que a sinalização por RA contraria os efeitos de dessincronização da via ED nos sómitos. No Capítulo 2, o nosso objetivo foi testar a presença de assimetrias in vivo no movimento das células precursoras durante a formação dos sómitos. Através da utilização de live imaging e da linha transgénica Tg(sox17:GFP), observámos que um grupo de células próximas à VK apresenta assimetrias ao adquirir posições cada vez mais anteriores sucessivamente no lado esquerdo, bem como em número. Ao seguir estas células até às 24 horas pós-fertilização, confirmámos que estas células integram os sómitos e de uma forma alternada, contudo mais proeminente no lado esquerdo. Confirmámos também que estas assimetrias são dependentes das pistas moleculares ED, pois embriões mutantes homozigotas para dand5 não apresentam assimetrias tanto na posição como no número de células e a sua integração nos sómitos é simétrica. Assim, os nossos resultados sugerem que as células precursoras dos sómitos exibem um comportamento assimétrico in vivo em resposta a sinais ED e que requerem a presença da proteína Dand5, secretada pelas células da VK. No Capítulo 3, investigámos o papel da VK nas células adjacentes. Descrevemos que a partir dos 10 ss, a presença da VK afeta uma população de células localizadas posteriormente à mesma. Observámos que essas células passam de um estado agregado para um estado migratório após entrarem em contato com a VK e migram em direção à região anterior, contribuindo para a formação dos sómitos. Para avaliar esta interação, examinámos o comportamento das células adjacentes no botão caudal em embriões sem VK, a fim de compreender melhor a sua função. Para isso, recorremos à ablação a laser das células precursoras da VK. Os nossos resultados mostraram que a ausência de VK comprometeu o movimento anterior e reduziu a expressão de myoD, sugerindo a sua importância no movimento das células do botão caudal e na especificação dos sómito. Estes resultados fornecem evidências preliminares de que a VK desempenha um papel crítico na especificação dos sómitos, tanto por meio de sinalização quanto possivelmente por um mecanismo mecânico. Portanto, descrevemos um papel adicional da VK no desenvolvimento embrionário do peixe-zebra. Por fim, o Capítulo 4 apresenta a implementação de um novo protocolo de hibridação in situ de fluorescência de single molecule (smFISH) em embriões wholemount de peixe-zebra com o objetivo de fornecer dados de maior resolução para uma melhor compreensão da dinâmica temporal e espacial da diminuição do lado esquerdo da expressão de dand5 durante a quebra de simetria. Este estudo identificou padrões de expressão assimétricos mais precoces de mRNA dand5 no polo anterior esquerdo da VK, sugerindo que as células anteriores do lado esquerdo são as primeiras a detetar o fluxo, e é nestas onde a maquinaria por trás da degradação do mRNA dand5 pode ser ativada. Assim, mostrámos que a assimetria do dand5 é estabelecida aos 6 ss, uma hora antes do que estava previamente descrito por métodos menos sensíveis. Os nossos resultados são congruentes com estudos prévios acerca da mecânica do fluxo na VK e da dinâmica de mRNA, contribuindo para uma melhor compreensão dos mecanismos subjacentes à quebra de simetria no peixe-zebra.Em conclusão, o nosso estudo relata a ligação entre o primeiro gene assimétrico no estabelecimento do eixo ED, dand5, e do OED nos movimentos da cauda de embriões de peixe zebra, estabelecendo assim a base para estudar o envolvimento de outros genes da cascata ED neste contexto. Os resultados apresentados nesta tese têm implicações para a compreensão do papel de sinais assimétricos na formação de estruturas simétricas e fornecem informações sobre os mecanismos subjacentes ao desenvolvimento embrionário. Além disso, esclarecemos o momento em que a assimetria de dand5 é estabelecida no peixe-zebra, proporcionando novas perspetivas para a compreensão do estabelecimento da assimetria ED em vertebrados.
Resumo Externamente, o corpo dos vertebrados é simétrico bilateralmente, no entanto, órgãos como o coração, intestino, pâncreas e fígado, pulmões e a vasculatura apresentam uma assimetria relativamente ao eixo Esquerda-Direita (ED), no que diz respeito ao seu posicionamento e/ou morfologia, numa disposição conservada denominada de situs solitus. O estabelecimento do eixo ED ocorre durante a embriogénese num processo coordenado após o estabelecimento dos eixos Antero-Posterior (AP) e Dorso-Ventral (DV). Esta assimetria é estabelecida durante o desenvolvimento embrionário por meio de um processo altamente regulado que envolve o organizador esquerda-direita (OED). O OED é responsável pela quebra da simetria bilateral através de um fluxo de fluido assimétrico que é gerado por cílios móveis. Este fluxo assimétrico leva a uma diminuição na expressão do mRNA de Dand5, um potente inibidor de sinalização Nodal, no lado esquerdo do OED, o que permite que Nodal, uma proteína envolvida no estabelecimento e transdução da assimetria ED, persista apenas no lado esquerdo da placa mesodérmica lateral (PML). Desta forma, uma cascata de eventos de expressão genética é desencadeada que resultam no desenvolvimento de órgãos internos com assimetria ED. No peixe-zebra, o OED é chamado de Vesícula de Kupffer (VK), esta é uma estrutura esférica e monociliada dentro da qual está presente um fluído e que se desenvolve durante os primeiros estadios de segmentação no final posterior da notocorda. A VK é derivada de um agregado de células superficiais localizadas perto do escudo embrionário, conhecidas como Células Percursoras Dorsais (CPD). As CPDs formam um padrão de roseta plana e circular, que depois coalesce numa estrutura tridimensional com uma cavidade central preenchida com fluido. À medida que a VK se forma, o influxo de fluido e a ciliogénese coincidem, resultando na expansão do lúmen e de cada célula da VK origina um único cílio que se estende para o lúmen. Subsequentemente, a VK passa por uma remodelação estrutural ao longo do eixo AP, levando a uma distribuição assimétrica das células ciliadas. Este processo depende de uma complexa interação de vários fatores, incluindo rearranjos no citoesqueleto induzidos pela notocorda, acúmulo de matriz extracelular, a função da Rho quinase Rock2b, Miosina não-muscular II e forças mecânicas de arrasto sobre a VK provocadas pelo movimento das células da cauda. A expressão do gene dand5 na VK é inicialmente simétrica, no entanto, no estadio de 8 sómitos (ss), a sua expressão passa a ser assimétrica, estando mais expresso no lado direito, num processo que é dependente do fluxo assimétrico no sentido anti-horário. O fluxo é gerado pelos cílios móveis e detetado pelo complexo de policistinas Pkd1l1 e Pkd2, no entanto o exato mecanismo de deteção do fluxo ainda não é completamente conhecido. Todavia, recentes descobertas sugerem que o Bicc1 tem um papel importante na desestabilização e inibição da tradução de dand5, tanto em ratos quanto em sapos, no lado esquerdo do OED, de uma maneira que é dependente do fluxo. Esse processo envolve a ação conjunta de Dicer1 e Pkd2, embora ainda não esteja claro se Bicc1 e Dicer cooperam na regulação de microRNAs para mediar a diminuição de dand5. Além disso, o mecanismo preciso pelo qual o Bicc1 interage com a região 3'-UTR de dand5 no peixe-zebra ainda não é conhecido, portanto, mais estudos são necessários.´ O gene nodal do peixe-zebra southpaw (spaw) desempenha um papel crucial no estabelecimento e transdução da assimetria ED. Inicialmente, spaw é expresso bilateralmente num padrão simétrico nas células adjacentes à VK por volta dos 4-6 ss. Por volta dos 10-12 ss, a expressão de spaw torna-se assimétrica no lado esquerdo da PML devido à remoção da inibição Dand5-Southpaw. Tal mecanismo permite que Spaw induza a expressão de seu mRNA, que subsequentemente se espalha da região posterior para a anterior do lado esquerdo da PML até aos 22 ss. O confinamento de Spaw no lado esquerdo é alcançado por meio de diferentes fatores secretados da família TGF-β. Lefty1 fornece uma barreira na linha média, Lefty2 cria uma barreira anterior no campo cardíaco esquerdo e a sinalização BMP forma uma barreira posterior. Juntos, estes processos coordenam o estabelecimento e a manutenção da assimetria ED no peixe-zebra que se traduz numa organogénese assimétrica posteriormente. Tão crucial como a quebra da simetria durante o desenvolvimento embrionário, é manter a simetria em estruturas como os sómitos que são a base para a musculatura simétrica, vertebras e inervação. Os sómitos formam-se de forma periódica e simétrica a partir da mesoderme pre somítica que não é segmentada num processo chamado de somitogénese. Este processo ocorre por meio de um mecanismo de clock de segmentação e frente de onda. O comprimento de cada somito é regulado por uma combinação do período do clock e da velocidade da frente de onda, regulado por gradientes morfogénicos de FGF, Wnt e ácido retinóico (RA). Embora a via de padronização ED instrua o desenvolvimento embrionário para a formação de padrões assimétricos, existem pistas moleculares compartilhadas para formar estruturas tanto simétricas quanto assimétricas. Nomeadamente, é sugerido que a sinalização por RA contraria os efeitos de dessincronização da via ED nos sómitos. No Capítulo 2, o nosso objetivo foi testar a presença de assimetrias in vivo no movimento das células precursoras durante a formação dos sómitos. Através da utilização de live imaging e da linha transgénica Tg(sox17:GFP), observámos que um grupo de células próximas à VK apresenta assimetrias ao adquirir posições cada vez mais anteriores sucessivamente no lado esquerdo, bem como em número. Ao seguir estas células até às 24 horas pós-fertilização, confirmámos que estas células integram os sómitos e de uma forma alternada, contudo mais proeminente no lado esquerdo. Confirmámos também que estas assimetrias são dependentes das pistas moleculares ED, pois embriões mutantes homozigotas para dand5 não apresentam assimetrias tanto na posição como no número de células e a sua integração nos sómitos é simétrica. Assim, os nossos resultados sugerem que as células precursoras dos sómitos exibem um comportamento assimétrico in vivo em resposta a sinais ED e que requerem a presença da proteína Dand5, secretada pelas células da VK. No Capítulo 3, investigámos o papel da VK nas células adjacentes. Descrevemos que a partir dos 10 ss, a presença da VK afeta uma população de células localizadas posteriormente à mesma. Observámos que essas células passam de um estado agregado para um estado migratório após entrarem em contato com a VK e migram em direção à região anterior, contribuindo para a formação dos sómitos. Para avaliar esta interação, examinámos o comportamento das células adjacentes no botão caudal em embriões sem VK, a fim de compreender melhor a sua função. Para isso, recorremos à ablação a laser das células precursoras da VK. Os nossos resultados mostraram que a ausência de VK comprometeu o movimento anterior e reduziu a expressão de myoD, sugerindo a sua importância no movimento das células do botão caudal e na especificação dos sómito. Estes resultados fornecem evidências preliminares de que a VK desempenha um papel crítico na especificação dos sómitos, tanto por meio de sinalização quanto possivelmente por um mecanismo mecânico. Portanto, descrevemos um papel adicional da VK no desenvolvimento embrionário do peixe-zebra. Por fim, o Capítulo 4 apresenta a implementação de um novo protocolo de hibridação in situ de fluorescência de single molecule (smFISH) em embriões wholemount de peixe-zebra com o objetivo de fornecer dados de maior resolução para uma melhor compreensão da dinâmica temporal e espacial da diminuição do lado esquerdo da expressão de dand5 durante a quebra de simetria. Este estudo identificou padrões de expressão assimétricos mais precoces de mRNA dand5 no polo anterior esquerdo da VK, sugerindo que as células anteriores do lado esquerdo são as primeiras a detetar o fluxo, e é nestas onde a maquinaria por trás da degradação do mRNA dand5 pode ser ativada. Assim, mostrámos que a assimetria do dand5 é estabelecida aos 6 ss, uma hora antes do que estava previamente descrito por métodos menos sensíveis. Os nossos resultados são congruentes com estudos prévios acerca da mecânica do fluxo na VK e da dinâmica de mRNA, contribuindo para uma melhor compreensão dos mecanismos subjacentes à quebra de simetria no peixe-zebra.Em conclusão, o nosso estudo relata a ligação entre o primeiro gene assimétrico no estabelecimento do eixo ED, dand5, e do OED nos movimentos da cauda de embriões de peixe zebra, estabelecendo assim a base para estudar o envolvimento de outros genes da cascata ED neste contexto. Os resultados apresentados nesta tese têm implicações para a compreensão do papel de sinais assimétricos na formação de estruturas simétricas e fornecem informações sobre os mecanismos subjacentes ao desenvolvimento embrionário. Além disso, esclarecemos o momento em que a assimetria de dand5 é estabelecida no peixe-zebra, proporcionando novas perspetivas para a compreensão do estabelecimento da assimetria ED em vertebrados.
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Palavras-chave
asymmetric migratory mesendodermal