A carregar...
Publicação
Generation and Characterization of Transgenic Zebrafish Lines for the Study of Vertebrate Brain Structure and Function
| Nome: | Descrição: | Tamanho: | Formato: | |
|---|---|---|---|---|
| 4.26 MB | Adobe PDF |
Orientador(es)
Resumo(s)
Understanding the functioning and organization of the brain is crucial to decipher how sensory stimuli are translated into behaviour. Over the last decades, zebrafish has become a model of excellence to address this challenge, with its simple and well described nervous sys-tem. The development of new transgenic tools and sophisticated imaging techniques, allied to the embryos’ optical clarity and external development, made it possible to generate genet-ically-modified animals that revolutionized the study of neuron morphology and interaction.
The current work initiated the establishment of a new zebrafish transgenic line, to be used in future studies of neuronal polarization, process characterized by axons extension dur-ing the formation of a functional neuronal network. The kif5c560 protein, expressed at axon terminals, was previously identified as the earliest marker of axonogenesis, thus revealing an enormous potential to study the neuronal polarization process. One-cell stage zebrafish em-bryos were microinjected with 10xUAS:Kif5c560-EYFP DNA, in the presence of tol2 mRNA, with a successful generation of fluorescently-labelled larvae. Five lines were selected to be raised as F-1 lines and germ line transmission was confirmed on the next generation (F0).
In parallel, the neuronal expression of other five previously-established lines was studied through confocal microscopy. Although gene expression had already been described, to the best of our knowledge none of the exact lines studied had been registered in the most com-monly used zebrafish brain atlases, with great importance for the scientific community as they aggregate information from hundreds of lines into a common reference space. Therefore, the present work was not only essential in confirming the reported expression pattern, increasing the degree of confidence in it, but was also an important step towards the integration of these lines into an international atlas. Neurological disease-associated genes are conserved in zebrafish, so the availability of this information may contribute to future studies on neurolog-ical disorders and the identification of molecular drug targets.
Compreender o funcionamento e a organização do cérebro é crucial para decifrar como os estímulos sensoriais são convertidos em comportamento. Nas últimas décadas, o peixe-zebra tornou-se um modelo de excelência para enfrentar este desafio, pelo seu sistema ner-voso simples e bem descrito. O desenvolvimento de novas ferramentas transgénicas e técnicas de imagem sofisticadas, aliadas à clareza ótica e desenvolvimento externo do embrião, possi-bilitaram a criação de animais geneticamente modificados que revolucionaram o estudo da morfologia e interação dos neurónios. O presente trabalho iniciou o estabelecimento de uma nova linha transgénica de peixe-zebra, a ser utilizada em estudos futuros de polarização neuronal, processo caracterizado pela extensão axonal durante a formação de uma rede neuronal funcional. A proteína Kif5c560, ex-pressa no terminal dos axónios, foi previamente identificada como o marcador mais precoce do processo de axonogénese, revelando assim um enorme potencial para estudar o processo de polarização neuronal. Embriões de peixe-zebra no estadio de uma célula foram injetados com o plasmídeo 10xUAS:Kif5c560-EYFP e mRNA de tol2, com a geração bem sucedida de larvas com fluorescência. Cinco linhas foram selecionadas para serem criadas como linhas F-1 e a transmissão do transgene foi confirmada na geração seguinte (F0). Paralelamente, a expressão neuronal de outras cinco linhas previamente estabelecidas foi estudada por microscopia confocal. Embora a expressão destes genes tenha já sido descrita, até onde sabemos nenhuma das exatas linhas estudadas foi registada nos atlas cerebrais de peixe-zebra comumente utilizados, com uma grande importância para a comunidade científica por agregarem informação acerca de centenas de linhas num espaço comum de referência. Assim sendo, o presente trabalho foi não só essencial para confirmar o padrão de expressão relatado, aumentando assim o grau de confiança no mesmo, como também um importante passo para a integração destas linhas num atlas internacional. Genes associados a doenças neurológicas são conservados no peixe-zebra, logo a disponibilidade desta informação poderá contribuir para o estudo de distúrbios neurológicos e para a possível identificação de alvos moleculares.
Compreender o funcionamento e a organização do cérebro é crucial para decifrar como os estímulos sensoriais são convertidos em comportamento. Nas últimas décadas, o peixe-zebra tornou-se um modelo de excelência para enfrentar este desafio, pelo seu sistema ner-voso simples e bem descrito. O desenvolvimento de novas ferramentas transgénicas e técnicas de imagem sofisticadas, aliadas à clareza ótica e desenvolvimento externo do embrião, possi-bilitaram a criação de animais geneticamente modificados que revolucionaram o estudo da morfologia e interação dos neurónios. O presente trabalho iniciou o estabelecimento de uma nova linha transgénica de peixe-zebra, a ser utilizada em estudos futuros de polarização neuronal, processo caracterizado pela extensão axonal durante a formação de uma rede neuronal funcional. A proteína Kif5c560, ex-pressa no terminal dos axónios, foi previamente identificada como o marcador mais precoce do processo de axonogénese, revelando assim um enorme potencial para estudar o processo de polarização neuronal. Embriões de peixe-zebra no estadio de uma célula foram injetados com o plasmídeo 10xUAS:Kif5c560-EYFP e mRNA de tol2, com a geração bem sucedida de larvas com fluorescência. Cinco linhas foram selecionadas para serem criadas como linhas F-1 e a transmissão do transgene foi confirmada na geração seguinte (F0). Paralelamente, a expressão neuronal de outras cinco linhas previamente estabelecidas foi estudada por microscopia confocal. Embora a expressão destes genes tenha já sido descrita, até onde sabemos nenhuma das exatas linhas estudadas foi registada nos atlas cerebrais de peixe-zebra comumente utilizados, com uma grande importância para a comunidade científica por agregarem informação acerca de centenas de linhas num espaço comum de referência. Assim sendo, o presente trabalho foi não só essencial para confirmar o padrão de expressão relatado, aumentando assim o grau de confiança no mesmo, como também um importante passo para a integração destas linhas num atlas internacional. Genes associados a doenças neurológicas são conservados no peixe-zebra, logo a disponibilidade desta informação poderá contribuir para o estudo de distúrbios neurológicos e para a possível identificação de alvos moleculares.
Descrição
Palavras-chave
zebrafish Kif5c560 protein confocal microscopy brain atlases