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Publicação
UNVEILING THE ROLE OF DPS, ENDOIII AND PPK FOR DNA PROTECTION AND REPAIR IN DEINOCOCCUS RADIODURANS UPON EXPOSURE TO GENOTOXIC STRESSure t
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Autores
Orientador(es)
Resumo(s)
Deinococcus radiodurans (Dr) is known for showing great resistance to ionizing radiation, and
desiccation amongst other extreme conditions. This bacterium possesses different groups of
proteins which are involved in the response to several stress agents by either protecting the
DNA from suffering damage, repairing efficiently the damaged DNA or even being involved
in the metabolism small antioxidant molecules, capable of protecting the proteome so that it
can continue working under stress conditions. In this work we focused on two DNA binding
protein under starved conditions (Dps1 and Dps2) present in Dr, which are able to bind and
protect DNA against damage, on three Endonuclease III proteins (EndoIII-1, EndoIII-2 and
EndoIII-3) which remove oxidation damaged bases in DNA through the Base Excision Repair
(BER) pathway and on two Polyphosphate kinases (PPK1 and PPK2) that are responsible for
the metabolism of inorganic polyphosphate (PolyP) which is involved in the defense against
oxidative stress. To understand the role of these proteins and their possible interplay, we
constructed and studied the resistance to stress of both single, double and triple knockout
mutants, of each of these proteins, through the Tripartite Ligation Method, using Overlap
PCR. The induced stress was exposure to UV-C radiation, hydrogen peroxide and methyl
viologen. The stress response was compared with the wild type bacterium. Moreover, a single
amino acid mutation of EndoIII-2 was generated in order to attempt its crystallization, to
understand its structure and the molecular mechanisms involved in its activity.
Deinococcus radiodurans (Dr) é uma bactéria conhecida por demonstrar uma extraordinária resistência a radiação ionizante, desidratação extrema, stress oxidativo entre outras condições extremas. Esta bactéria possui diferentes famílias de proteínas que estão envolvidas na resposta a diferentes agentes de stress quer através de proteger diretamente o DNA, reparar eficientemente o DNA danificado ou ainda através de estarem envolvidas no metabolismo de moléculas antioxidantes de pequenas dimensões que estão envolvidos na proteção do proteoma em caso de dano severo. Este trabalho focou-se em 2 Dps (DNA binding protein under starved conditions) presentes em Dr (Dps1 e Dps2), que se ligam ao DNA protegendo- o de dano, em 3 Endonucleases III (EndoIII-1, EndoIII-2 e EndoIII-3) que são responsáveis por reparar o DNA danificado através do mecanismo de reparação por excisão de base e ainda em 2 cinases polifosfatases (PPK1 e PPK2) que são responsáveis pelo metabolismo de polifosfato inorgânico que está envolvido na defesa contra stress oxidativo. Com o intuito de compreender o papel de cada uma destas proteínas e estudar uma possível cooperação entre elas, foram construídos mutantes de deleção simples, duplos e triplos, através do método de ligação tripartido, usando PCR de fusão. O stress induzido foi a exposição a radiação ultravioleta-C, peróxido de hidrogénio e metil viologénio e a resposta a estas condições foi comparada com a resposta obtida pela bactéria nativa. Adicionalmente, uma alteração de um aminoácido na sequência da EndoIII-2 foi construída de maneira a tentar proceder à sua cristalização de maneira a compreender a sua estrutura e os mecanismos moleculares envolvidos na sua atividade.
Deinococcus radiodurans (Dr) é uma bactéria conhecida por demonstrar uma extraordinária resistência a radiação ionizante, desidratação extrema, stress oxidativo entre outras condições extremas. Esta bactéria possui diferentes famílias de proteínas que estão envolvidas na resposta a diferentes agentes de stress quer através de proteger diretamente o DNA, reparar eficientemente o DNA danificado ou ainda através de estarem envolvidas no metabolismo de moléculas antioxidantes de pequenas dimensões que estão envolvidos na proteção do proteoma em caso de dano severo. Este trabalho focou-se em 2 Dps (DNA binding protein under starved conditions) presentes em Dr (Dps1 e Dps2), que se ligam ao DNA protegendo- o de dano, em 3 Endonucleases III (EndoIII-1, EndoIII-2 e EndoIII-3) que são responsáveis por reparar o DNA danificado através do mecanismo de reparação por excisão de base e ainda em 2 cinases polifosfatases (PPK1 e PPK2) que são responsáveis pelo metabolismo de polifosfato inorgânico que está envolvido na defesa contra stress oxidativo. Com o intuito de compreender o papel de cada uma destas proteínas e estudar uma possível cooperação entre elas, foram construídos mutantes de deleção simples, duplos e triplos, através do método de ligação tripartido, usando PCR de fusão. O stress induzido foi a exposição a radiação ultravioleta-C, peróxido de hidrogénio e metil viologénio e a resposta a estas condições foi comparada com a resposta obtida pela bactéria nativa. Adicionalmente, uma alteração de um aminoácido na sequência da EndoIII-2 foi construída de maneira a tentar proceder à sua cristalização de maneira a compreender a sua estrutura e os mecanismos moleculares envolvidos na sua atividade.
Descrição
Palavras-chave
Deinococcus radiodurans DNA repair DNA protection Oxidative stress Ultraviolet radiation