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Publicação
Estudos cinéticos em reacções de hidrólise enzimática de proteínas acelerada por ultrasons
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Orientador(es)
Resumo(s)
No decorrer do trabalho experimental que originou esta dissertação efectuaram-se vários
estudos com o intuito de estudar cineticamente a reacção de hidrólise enzimática de
proteínas acelerada por ultrasons.
Utilizaram-se quatro proteínas diferentes: albumina sérica bovina (BSA), anidrase
carbónica, ovalbumina e α-lactoalbumina que foram digeridas com tripsina.
No sentido de monitorizar em tempo real a reacção de hidrólise recorreu-se a
espectrofotometria ultravioleta-visivel, utilizando tecnologia NanoDrop® ND-1000, com
base nas características físico-químicas das cadeias polipeptídicas, bem como à
incorporação de um corante extrínseco através do ensaio de Bradford.
Efectuaram-se igualmente estudos de espectrofotometria de fluorescência, também
através da tecnologia NanoDrop® ND-3300, por incorporação de um fluoróforo
extrínseco, SYPRO® Orange, à estrutura proteica.
Para além dos ensaios espectrofotométricos, recorreu-se a uma nova metodologia de
quantificação proteica através da marcação isotópica com oxigénio 18O acoplada a
jusante com espectrometria de massa MALDI-TOF-MS.
Com base nos resultados obtidos, concluiu-se que através do protocolo testado de
digestão enzimática de proteínas acelerada por ultrasons não foi possível monitorizar em
tempo real a reacção, quer por espectrofotometria de UV-Vis, quer por espectrofotometria
de fluorescência através do fluoróforo SYPRO® Orange.
No que diz respeito à marcação isotópica por 18O também não foi possível efectuar
qualquer estudo cinético, uma vez que esta metodologia apenas permite a quantificação
relativa das amostras proteicas.
Descrição
Palavras-chave
Ultrasons UV-Vis Bradford Fluorescência SYPRO® Orange NanoDrop®