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Publicação
Evaluation of protamine/pDNAlanionic PAMAM dendrimer ternary complexes for hMSCs osteogenic differentiation induction
| Nome: | Descrição: | Tamanho: | Formato: | |
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Autores
Orientador(es)
Resumo(s)
The control of human Mesenchymal Stem Cells (hMSCs) differentiation towards the os-
teoblastic lineage is very important, especially in tissue engineering and regenerative
medicine. In this context, Bone Morphogenetic Protein 2 (BMP-2), a known osteogenic
differentiation factor, can be applied for hMSCs differentiation using a gene delivery
approach.
The main goal of the thesis was to develop new non-viral systems for the delivery
of the BMP-2 gene into hMSCs based on protamine (PS) and anionic poly(amidoamine)
dendrimers (PAMAM-COOH). First, PS/pDNA binary complexes were prepared, where
pDNA was efficiently packed, neutralized and protected from serum nucleases. Gene
expression levels using these binary complexes and HEK 293T cells were, however, in-
significant (EGFP and luciferase reporter genes were used in these studies). So, PS/pDNA/
PAMAM-COOH ternary complexes were then prepared using non-cytotoxic PS/pDNA
complexes at a N/P of 7 (N = guanidinium groups in protamine; P = phosphate groups in
the pDNA backbone) and several generations of dendrimers (G0.5, G1.5 and G4.5) at C/P
ratios of 4, 8 and 12 (C = carboxylate groups in the dendrimer; P = phosphate groups in
the pDNA backbone). This was done to see if the combination with an anionic polymer
could weaken the electrostatic bonds within the binary complex and increase gene expres-
sion. A small improvement in transfection efficiency was, indeed, observed although the
values remained very low, far from what was expected. Notwithstanding, one decided to
proceed with the best performing ternary complexes and evaluate their behaviour in the
transfection of hMSCs with a pDNA encoding BMP-2. Here, it was hypothesized that low
transfection levels could still induce the osteogenic differentiation of hMSCs. Compared
to the control with dexamethasone (a strong inducer of osteogenesis), the differentiation
of hMSCs towards the osteoblastic lineage occurred but to a very low extent, as assessed
by classical markers of the process.
O controlo da diferenciação de Células Estaminais Mesenquimais humanas (hMSCs) na linhagem osteoblástica é extremamente importante, sobretudo na engenharia de tecidos e medicina regenerativa. Deste modo, a Proteína Morfogenética do Osso 2 (BMP-2), um fator de diferenciação osteogénico, pode ser aplicada na diferenciação de hMSCs utilizando terapia genética. O principal objetivo desta tese foi o desenvolvimento de sistemas não-virais com pro- tamina (PS) e dendrímeros poli(amidoamina) aniónicos (PAMAM-COOH), para a entrega do gene BMP-2 em hMSCs . Primeiro, os complexos binários PS/pDNA foram preparados, nos quais o pDNA foi eficazmente condensado, neutralizado e protegido de nucleases do soro. Os níveis de expressão génica utilizando os complexos binários e células HEK 293T foram, no entanto, insignificantes (genes repórter EGFP e luciferase foram usados nes- tes estudos). Assim, foram preparados complexos ternários PS/pDNA/PAMAM-COOH utilizando os complexos não-citotóxicos PS/pDNA a N/P 7 (N = grupos guanidina na protamina; P = grupos fosfato no pDNA) e várias gerações de dendrímeros (G0.5, G1.5 e G4.5), a rácios C/P 4, 8 e 12 (C = grupos carboxilato no dendrímero; P = grupos fosfato no pDNA). Isto teve como objetivo avaliar se a combinação de um polímero aniónico poderia enfraquecer as ligações eletrostáticas no complexo binário e aumentar a expressão génica. De facto, foi observado um pequeno aumento na eficiência de transfeção, apesar dos valo- res continuarem mais baixos do que o esperado. Ainda assim, os complexos ternários com melhor transfeção foram utilizados de forma a avaliar o seu comportamento na transfeção de hMSCs com pDNA codificante de BMP-2. De facto, foi levantada a hipótese de que bai- xos níveis de transfeção seriam capazes de induzir a diferenciação osteogénica das hMSCs. Comparativamente ao controlo com dexametasona (um forte indutor da osteogénese), a diferenciação de hMSCs na linhagem osteoblástica ocorreu, porém, em menor extensão, como determinado por marcadores clássicos deste processo.
O controlo da diferenciação de Células Estaminais Mesenquimais humanas (hMSCs) na linhagem osteoblástica é extremamente importante, sobretudo na engenharia de tecidos e medicina regenerativa. Deste modo, a Proteína Morfogenética do Osso 2 (BMP-2), um fator de diferenciação osteogénico, pode ser aplicada na diferenciação de hMSCs utilizando terapia genética. O principal objetivo desta tese foi o desenvolvimento de sistemas não-virais com pro- tamina (PS) e dendrímeros poli(amidoamina) aniónicos (PAMAM-COOH), para a entrega do gene BMP-2 em hMSCs . Primeiro, os complexos binários PS/pDNA foram preparados, nos quais o pDNA foi eficazmente condensado, neutralizado e protegido de nucleases do soro. Os níveis de expressão génica utilizando os complexos binários e células HEK 293T foram, no entanto, insignificantes (genes repórter EGFP e luciferase foram usados nes- tes estudos). Assim, foram preparados complexos ternários PS/pDNA/PAMAM-COOH utilizando os complexos não-citotóxicos PS/pDNA a N/P 7 (N = grupos guanidina na protamina; P = grupos fosfato no pDNA) e várias gerações de dendrímeros (G0.5, G1.5 e G4.5), a rácios C/P 4, 8 e 12 (C = grupos carboxilato no dendrímero; P = grupos fosfato no pDNA). Isto teve como objetivo avaliar se a combinação de um polímero aniónico poderia enfraquecer as ligações eletrostáticas no complexo binário e aumentar a expressão génica. De facto, foi observado um pequeno aumento na eficiência de transfeção, apesar dos valo- res continuarem mais baixos do que o esperado. Ainda assim, os complexos ternários com melhor transfeção foram utilizados de forma a avaliar o seu comportamento na transfeção de hMSCs com pDNA codificante de BMP-2. De facto, foi levantada a hipótese de que bai- xos níveis de transfeção seriam capazes de induzir a diferenciação osteogénica das hMSCs. Comparativamente ao controlo com dexametasona (um forte indutor da osteogénese), a diferenciação de hMSCs na linhagem osteoblástica ocorreu, porém, em menor extensão, como determinado por marcadores clássicos deste processo.
Descrição
Palavras-chave
Protamine Anionic PAMAM dendrimer Gene therapy Osteogenic differentiation human Mesenchymal Stem Cells Bone Morphogenetic Protein 2