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Publicação
Optimization of in vivo electroporation and comparison to microinjection as delivery methods for transgenesis in zebrafish (Danio rerio). Generation of a new neuronal zebrafish line
| Nome: | Descrição: | Tamanho: | Formato: | |
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Autores
Orientador(es)
Resumo(s)
Transgenic zebrafish are important models for biomedical research. There are several
technologies available for the generation of transgenics and for genome editing. However,
methods for the delivery of exogenous components remain limited. In Zebrafish, the most used
method is microinjection, which requires sophisticated technical skills and presents a low
integration rate of large constructs. Alternatively, a few studies reported the use of
electroporation as a delivery method for the generation of transgenic zebrafish; however, these
protocols contain some limitations that reduce their widespread applicability. To overcome
this, we based on the most recent published work reporting electroporation in zebrafish
embryos, to implement optimizations in order to increase the number of embryos
electroporated, the efficiency of plasmid DNA delivery and its integration in the germline.
Electroporation rounds of 30 one-cell stage zebrafish embryos with 300 ng/uL of plasmid DNA
in PBS using 35 V poring pulse and 5 V transfer pulse yielded the highest survival and efficiency.
Compared to microinjection, the optimized electroporation protocol achieved similar
fluorescence intensity and expression pattern, opening the way to becoming a practical and
efficient alternative to microinjection.
In parallel, a new calcium indicator pan-neuronal transgenic zebrafish line,
elalv3:GCaMP6fEF05 was generated, through microinjection into one-cell stage zebrafish
embryos, followed by 3 rounds of fish crosses, screens, selection and raising. The improvement
of delivery methods, such as electroporation, will expand the generation of new zebrafish lines
for the study of developmental and molecular biology that ultimately allows the exploration of
new human therapeutic avenues.
Os peixes-zebra transgénicos são modelos importantes para a pesquisa biomédica. Existem várias tecnologias disponíveis para a geração de transgénicos e edição do genoma. No entanto, os métodos para a entrega de componentes exógenos permanecem limitados. No peixe-zebra, o método mais utilizado é a microinjeção, que requer habilidades técnicas sofisticadas e apresenta taxa de integração de grandes construções reduzida. Alternativamente, alguns estudos relataram o uso de eletroporação como um método de entrega para a geração de peixes-zebra transgénicos; no entanto, esses protocolos contêm algumas limitações que reduzem sua aplicabilidade generalizada. Como tal, tendo por base um trabalho publicado recentemente relatando a eletroporação de embriões de peixe-zebra, implementaram-se otimizações a fim de aumentar o número de embriões eletroporados, a eficiência da entrega de DNA plasmídico e a sua integração na linha germinativa. Ciclos de eletroporação de 30 embriões de peixe-zebra no estado de uma célula com 300 ng / uL de DNA plasmídico em PBS usando um pulso de formação de poros de 35 V e pulso de transferência de 5 V obtiveram a maior taxa de sobrevivência e eficiência. Comparado à microinjeção, o protocolo de eletroporação otimizado alcançou uma intensidade de fluorescência e padrão de expressão semelhantes, abrindo caminho para se tornar uma alternativa prática e eficiente à microinjeção. Em paralelo, uma nova linha de peixe-zebra transgénica pan-neuronal, elalv3: GCaMP6fEF05 foi gerada, através da microinjeção em embriões no estado de uma célula, seguida por 3 rondas de cruzamentos de peixes, screens, seleção e criação. A otimização dos métodos de entrega, como a eletroporação, permite expandir a geração de novas linhas de peixe-zebra para o estudo da biologia molecular e do desenvolvimento que, em última análise, permite a exploração de novos caminhos terapêuticos para humanos.
Os peixes-zebra transgénicos são modelos importantes para a pesquisa biomédica. Existem várias tecnologias disponíveis para a geração de transgénicos e edição do genoma. No entanto, os métodos para a entrega de componentes exógenos permanecem limitados. No peixe-zebra, o método mais utilizado é a microinjeção, que requer habilidades técnicas sofisticadas e apresenta taxa de integração de grandes construções reduzida. Alternativamente, alguns estudos relataram o uso de eletroporação como um método de entrega para a geração de peixes-zebra transgénicos; no entanto, esses protocolos contêm algumas limitações que reduzem sua aplicabilidade generalizada. Como tal, tendo por base um trabalho publicado recentemente relatando a eletroporação de embriões de peixe-zebra, implementaram-se otimizações a fim de aumentar o número de embriões eletroporados, a eficiência da entrega de DNA plasmídico e a sua integração na linha germinativa. Ciclos de eletroporação de 30 embriões de peixe-zebra no estado de uma célula com 300 ng / uL de DNA plasmídico em PBS usando um pulso de formação de poros de 35 V e pulso de transferência de 5 V obtiveram a maior taxa de sobrevivência e eficiência. Comparado à microinjeção, o protocolo de eletroporação otimizado alcançou uma intensidade de fluorescência e padrão de expressão semelhantes, abrindo caminho para se tornar uma alternativa prática e eficiente à microinjeção. Em paralelo, uma nova linha de peixe-zebra transgénica pan-neuronal, elalv3: GCaMP6fEF05 foi gerada, através da microinjeção em embriões no estado de uma célula, seguida por 3 rondas de cruzamentos de peixes, screens, seleção e criação. A otimização dos métodos de entrega, como a eletroporação, permite expandir a geração de novas linhas de peixe-zebra para o estudo da biologia molecular e do desenvolvimento que, em última análise, permite a exploração de novos caminhos terapêuticos para humanos.
Descrição
Palavras-chave
Zebrafish embryos Transgenesis Microinjection Electroporation Genetically encoded fluorescent reporters