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The role of α2,3- and α2,6-sialylation
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Autores
Orientador(es)
Resumo(s)
RESUMO: Os glicoconjugados que decoram a superfície celular e os lípidos e proteínas secretados
ocupam o ponto de encontro onde normalmente ocorrem interacções críticas homólogas
(hospedeiro-hospedeiro) e heterólogas (hospedeiro-patogénio). Apesar de ser
largamente aceite que os glicanos são parte integrante do processo de imunidade,
continua a não ser claro qual o papel que os glicanos, em toda a sua diversidade, tomam
no quadro geral da imunidade.
Os glicanos, que são frequentemente terminados por resíduos de ácido siálico, podem
ser alterados por factores externos, tais como patogénios, ou por acontecimentos
fisiológicos celulares específicos. Normalmente em posição terminal, as glico-estruturas
que contêm ácido siálico assumem um papel fundamental numa quantidade substancial
de receptores imunes envolvidos na adesividade e tráfico celular, tal como as Selectinas
e as Siglecs, das quais se sabe apresentarem uma relevante função imune.
À altura do início desta tese, era sabido que os ácidos siálicos expressos à superfície
das células poderiam modular mecanismos importantes nas respostas imunes
adaptativas. Considerando a posição de charneira que as células dendríticas (DCs)
ocupam na transição da resposta imune inata para a adaptativa, antecipámos que os
ácidos siálicos poderiam também modular mecanismos relevantes nas DCs humanas.
As DCs têm uma função muito relevante na verificação e captura antigénica, migração
para os gânglios linfáticos e apresentação antigénica aos linfócitos, uma sequência de
funções que conduz, em ultima instância, à indução da resposta inata adaptativa.
Considerando estas premissas, a nossa hipótese principal foi que os ácidos siálicos
podem influenciar funções relevantes das DCs, tais como captura de antigénios,
maturação, migração para os gânglios linfáticos e apresentação antigénica às células Para testar esta hipótese, dividimos o trabalho em quatro partes:
1) Analisámos os glicanos sialilados de superfície, expressos durante a diferenciação
de monócitos humanos em DCs (moDCs). Os nossos dados mostraram que a
expressão dos glicanos com ligações em O (O-glicanos) e sialilados em α2,3, assim
como glicanos com ligações em N (N-glicanos) sialilados em α2,6 e α2,3 aumentou
durante o processo de diferenciação das moDCs. Contribuindo para esta nova
configuração glicosídica, três sialiltransferases (STs) poderão estar envolvidas: a
ST6Gal-1 correlaciona-se com a expressão aumentada de N-glicanos sialilados em
α2,6; a ST3Gal-1 contribui para a sialilação em α2,3 de O-glicanos, em especial de
antigénios T; e a ST3Gal-4 poderá ser responsável pelo aumento de N-glicanos
sialilados em α2,3. Após estímulo e consequente maturação das moDCs, ambos os
níveis de expressão génica de ST6Gal-1 e ST3Gal-4 são negativamente modificados
sendo, também, que a expressão de ST3Gal-1 varia consoante o estímulo.
2) Estudámos posteriormente as consequências da modulação dos ácidos siálicos de
superfície nas funções das DCs. Observámos que a remoção dos ácidos siálicos de
superfície diminui significativamente a capacidade de macropinocitose e endocitose
mediada por receptores nas moDCs. Em contrapartida, o tratamento com sialidase
aumentou significativamente a capacidade das moDCs para fagocitar Escherichia coli.
Determinou-se também que este mecanismo requer a existência de ácido siálico
presente nas E. coli indicando um mecanismo de interacção hospedeiro-patogénio
dependente de ácido siálico em ambas as partes envolvidas.
As moDCs tratadas com sialidase também apresentam um nível superior de expressão
de moléculas de MHC e moléculas co-estimulatórias, sugerindo um fenótipo celular mais
maduro. Recorrendo ao modelo de ratinho, utilizaram-se DCs derivadas de células da
medula (BMDCs) de ratinhos deficientes em ST3Gal-1 e ST6Gal-1. Estes ensaios
revelaram que quer a endocitose quer a maturação são influenciadas por modificações
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nos glicanos sialilados em α2,3 ou α2,6. A detecção e quantificação de proteínas Nglicosiladas
e sialiladas em α2,6 apontou para um potencial envolvimento de integrinas
β2 nestes mecanismos.
3) O efeito da sialilação em α2,6 na migração das DCs para os gânglios linfáticos foi
também analisado. Observámos que BMDCs deficientes para ST6Gal-1 apresentam
uma redução de cerca de 50% nos níveis de migração das DCs para os gânglios
linfáticos, tal como aferido em ensaios de inflamação in situ e estudos de transferência
adoptiva de células. Uma redução dos níveis deste tipo de migração foi também
observada quando BMDCs nativas foram transferidas para ratinhos receptores
deficientes em ST6Gal-1. São, contudo, necessários mais ensaios de forma a identificar
as moléculas envolvidas neste processo.
4) Por último, analisámos o impacto da sialilação na estimulação antigénica das DCs às
células T. Assim, concluiu-se que moDCs tratadas com sialidase apresentam um nível
de expressão superior de IL-12, TNF-ɑ, IL-6 e IL-10, e activação do factor de transcrição
nuclear kappa B (NF-κB). As DCs tratadas com sialidase induziram uma maior
proliferação nas células T, com expressão correspondente de interferão-γ. Este dado
sugere que a remoção de ácidos siálicos de superfície contribui para o desenvolvimento
de uma resposta pro-inflamatória do tipo 1 por células T auxiliares (resposta Th1).
Considerando estes dados no seu todo, concluímos que o ácido siálico tem um papel
marcante nas funções imunes das DCs. Alterações à concentração de ácido siálico à
superfície das células podem alterar a endocitose/fagocitose, maturação, migração para
os tecidos e gânglios linfáticos e capacidade estimulatória para com as células T.
Complementando estes dados, as ligações glicosídicas de ácidos siálicos criados por
ST6Gal-1 e ST3Gal-1 são funcionalmente relevantes. A modulação programada da
sialilação do glicocálice, mediada por sialidases individuais ou sialiltransferases é uma possibilidade aceitável para a melhoria da fagocitose por DCs e da sua potência
imunológica. Este facto tem um significado particular para imunoterapias baseadas em
DCs, podendo provar-se decisivo para a sua eficiência e aplicabilidade num futuro muito
próximo.-------------------------------ABSTRACT: Glycans decorating cell surface and secreted proteins and lipids occupy the junction
where critical host–host and host-pathogen interactions occur. In spite of the wide
acceptance that glycans are centrally implicated in immunity, exactly how glycans and
their variety and variability contribute to the overall immune response remains poorly
defined.
Glycans, frequently terminated by sialic acid residues, may be modified by external
factors such as pathogens or upon specific physiological cellular events. The terminal,
privileged positions of sialic acid-modified structures makes them key, fundamental
determinants for a number of immune receptors with known involvement in cellular
adhesiveness and cell trafficking, such as Selectins and Siglecs, with known relevant
immune functions. At the time this thesis was initiated, it was established that sialic acids
expressed at cell surface could modulate important mechanisms of the adaptive immune
responses. Given the key role of dendritic cells (DCs) in the transition from innate to the
adaptive immune responses, we anticipated that sialic acids could also modulate
important mechanisms of human DCs. DCs have a relevant role in antigen screening
and uptake, migration to lymph nodes and antigen presentation to lymphocytes,
ultimately triggering the adaptive immune response. Therefore, our primary hypothesis
was that sialic acids may modulate DC functions, such as antigen uptake, maturation,
homing to lymph nodes and antigen presentation to T cells.
To test this hypothesis, we divided our work in four parts.
1) Surface sialylated glycans expressed during differentiation from human monocytes to
DCs (moDCs) were analyzed. Our data showed that α2,3-sialylated O-glycans and α2,6-
and α2,3-sialylated N-glycans expression increased during moDC differentiation. Three
main sialyltransferases (STs) are committed with this new glycan configuration: ST6Gal-
1 correlates with the increased expression of α2,6-sialylated N-glycans; ST3Gal-1
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contributes for the α2,3-sialylation of O-glycans, especially T antigens; and ST3Gal-4
may contribute for the increased α2,3-sialylated N-glycans. Upon moDC maturation,
ST6Gal-1 and ST3Gal-4 are downregulated and ST3Gal-1 is altered in a stimulus
dependent manner.
2) We subsequently analyzed the consequences of the modulation of cell surface sialic
acids in DC functions. We observed that removing surface sialic acid by sialidase
significantly decreased the capacity of moDCs to micropinocytose and receptormediated
endocytose. In contrast, treatment with a sialidase significantly improved the
capacity of moDCs to phagocytose Escherichia coli. The improved phagocytosis
mechanism required E. coli sialic acids, indicating a mechanism of host–pathogen
interaction dependent on sialic acid moieties.
Sialidase-treated moDCs have increased expression of MHC and co-stimulatory
molecules, suggesting a more mature phenotype. Experiments using mouse bone
marrow-derived DCs (BMDCs) from ST3Gal-1-/- and ST6Gal-1-/- strains indicated that
endocytosis and maturation are influenced by changes in either α2,3 or α2,6-sialylated
glycans. The analysis of α2,6-sialylated, N-glycosylated proteins, strongly suggested the
potential involvement of β2 integrins, underlying these mechanisms.
3) The effect of α2,6-sialylation in DC homing to lymph nodes was also analyzed. We
observed that BMDCs deficient for ST6Gal-1 have an almost 50% reduction in DC
homing, as assayed by in situ inflammation and adoptive transfer studies. A reduction in
DC homing was also observed when wild type BMDCs were transferred into ST6Gal-1-/-
recipient mice. Further investigations are necessary to identify the molecules involved in
this process.
4) Finally, we also analyzed the impact of sialylation on DCs ability to prime T cells.
Sialidase-treated moDCs show increased gene expression of IL-12, TNF-α, IL-6 and IL-
10 cytokines, and activation of the transcription factor nuclear factor-κB. Sialidase33
treated DCs induced a higher proliferative response of T cells with concomitant higher
expression of interferon-γ, suggesting that the clearance of cell surface sialic acids
contributes to the development of a T helper type 1 proinflammatory response.
Together, our data strongly support sialic acid’s relevance in DC immune functions.
Alterations of cell surface sialic acid content can alter the endocytosis/phagocytosis,
maturation, migration/homing and the ability for T cell priming in human DCs. Moreover,
sialic acid linkages created by ST6Gal-1 and ST3Gal-1 are functionally relevant. The
engineering of cell surface sialylation, mediated by individual sialidases or
sialyltransferases is a likely possibility to fine tune DC phagocytosis and immunological
potency, with particular significance to DC-based therapies.
Descrição
Palavras-chave
Glicanos sialilados de superfície Imunidade Células dentríticas Células T Ácido siálico Terapia baseada em CDs Surface sialylated glycans Immunity Dentritic cells T cells α2,6-sialylation DCs based therapy