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Publicação
Detection of fluorescence by miniaturized in-chip- incorporated microscope for digital Polymerase Chain Reaction (dPCR)
| Nome: | Descrição: | Tamanho: | Formato: | |
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| 1.48 MB | Adobe PDF |
Autores
Orientador(es)
Resumo(s)
Classic biopsies are largely used for cancer diagnosis, which are often an invasive procedure. Alternatively,
circulating tumour DNA in the blood can be used as liquid biopsy. For DNA amplification, digital polymer-
ase chain reaction (dPCR) is becoming the selected procedure for extremely sensitive quantification of nu-
cleic acid molecules. Droplet-based microfluidic platforms are widely used in dPCR, since microfluidics
allows the efficient partitioning of samples in nanolitre-sized droplets, using oil-water interfaces, which sta-
tistically results in one or zero DNA strand target molecule per droplet prior to amplification, showing a
positive or negative fluorescent signal during amplification. In the present thesis, it is proposed a novel
dPCR detection technique using a miniaturized fluorescence microscope, UCLA Miniscope, integrated in a
droplet generator microfluidic device. The Miniscope was developed for neuroscience research due to its
portability and lightweight, to be carried by small animals. This fluorescence detection technique is straight-
forward, miniaturized, and inexpensive. To assess fluorescence detection sensitivity by the Miniscope, sev-
eral fluorescein isothiocyanate (FITC) solutions were tested, with concentrations ranging from 1 nM to 100
μM, and the lowest concentration to present a detectable fluorescence intensity was 1 μM. Moreover, posi-
tive and non-template-control PCR mixes of the cancer biomarker c-Myc after end-point amplification con-
taining fluorescent DNA-binding dye EvaGreen were tested, and it was possible to discriminate the positive
droplets and the non-template-control droplets. This research opens new prospects for the advancement of
improved lab-on-a-chip methods designed for dPCR analysis and for further biological and medical applica-
tions.
As biópsias clássicas são amplamente utilizadas para o diagnóstico do cancro, o que é muitas vezes um pro- cedimento invasivo. Alternativamente, o DNA tumoral circulante no sangue pode ser utilizado como biópsia líquida. Para a amplificação de DNA, a reação em cadeia da polimerase digital (dPCR) está a tornar-se o procedimento escolhido para a quantificação ultrassensível de moléculas de ácidos nucleicos. Plataformas de microfluídica baseadas em gotículas são muito utilizadas em dPCR, uma vez que a microfluídica permite a compartimentação eficiente de amostras em gotículas nanométricas, usando interfaces óleo-água, o que re- sulta estatisticamente em uma ou zero moléculas alvo de cadeias de DNA por gota antes da amplificação, mostrando um sinal fluorescente positivo ou negativo durante a amplificação. Nesta tese, é proposta uma nova técnica de deteção de dPCR usando um microscópio de fluorescência miniaturizado, o UCLA Minisco- pe, integrado num dispositivo microfluídico gerador de gotículas. O Miniscope foi desenvolvido para inves- tigação em neurociência devido à sua portabilidade e leveza, para ser transportado por pequenos animais. Este sistema de deteção de fluorescência é simples, miniaturizado e económico. Para avaliar a sensibilidade de deteção de fluorescência do Miniscope, foram testadas várias soluções de isotiocianato de fluoresceína (FITC), com concentrações entre 1 nM e 100 μM, sendo que a menor concentração a apresentar uma intensi- dade de fluorescência detetável foi 1 μM. Além disso, foram testadas misturas amplificadas por PCR do biomarcador de cancro c-Myc positivo e de controlo (sem DNA) contendo o corante fluorescente intercalan- te de DNA EvaGreen, e foi possível discriminar as gotículas positivas e as de controlo. Este trabalho abre novas perspectivas para o desenvolvimento de métodos melhorados de lab-on-chip para análise de dPCR e para outras aplicações médicas e biológicas.
As biópsias clássicas são amplamente utilizadas para o diagnóstico do cancro, o que é muitas vezes um pro- cedimento invasivo. Alternativamente, o DNA tumoral circulante no sangue pode ser utilizado como biópsia líquida. Para a amplificação de DNA, a reação em cadeia da polimerase digital (dPCR) está a tornar-se o procedimento escolhido para a quantificação ultrassensível de moléculas de ácidos nucleicos. Plataformas de microfluídica baseadas em gotículas são muito utilizadas em dPCR, uma vez que a microfluídica permite a compartimentação eficiente de amostras em gotículas nanométricas, usando interfaces óleo-água, o que re- sulta estatisticamente em uma ou zero moléculas alvo de cadeias de DNA por gota antes da amplificação, mostrando um sinal fluorescente positivo ou negativo durante a amplificação. Nesta tese, é proposta uma nova técnica de deteção de dPCR usando um microscópio de fluorescência miniaturizado, o UCLA Minisco- pe, integrado num dispositivo microfluídico gerador de gotículas. O Miniscope foi desenvolvido para inves- tigação em neurociência devido à sua portabilidade e leveza, para ser transportado por pequenos animais. Este sistema de deteção de fluorescência é simples, miniaturizado e económico. Para avaliar a sensibilidade de deteção de fluorescência do Miniscope, foram testadas várias soluções de isotiocianato de fluoresceína (FITC), com concentrações entre 1 nM e 100 μM, sendo que a menor concentração a apresentar uma intensi- dade de fluorescência detetável foi 1 μM. Além disso, foram testadas misturas amplificadas por PCR do biomarcador de cancro c-Myc positivo e de controlo (sem DNA) contendo o corante fluorescente intercalan- te de DNA EvaGreen, e foi possível discriminar as gotículas positivas e as de controlo. Este trabalho abre novas perspectivas para o desenvolvimento de métodos melhorados de lab-on-chip para análise de dPCR e para outras aplicações médicas e biológicas.
Descrição
Palavras-chave
Fluorescence detection Microfluidics Lab-on-chip Digital PCR Miniscope