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Detection and inhibition of β-lactamase activity in clinical isolates of Escherichia coli combining β-lactamase and efflux inhibitors using an MTT-based method: phenotypic and genotypic validation
Publication . Serra, Débora Carvalho; Machado, Diana; Viveiros, Miguel
RESUMO: A resistência aos antibióticos é uma ameaça cada vez maior na era da medicina moderna, na qual a
resistência aos β-lactâmicos se tornou um tema premente uma vez que é a classe de antibióticos mais usada
na clínica. Escherichia coli neutraliza os β-lactâmicos através da produção de β-lactamases, no entanto, a
actividade de efluxo e redução da expressão de porinas também contribuem para este fenótipo de
resistência. Neste trabalho, pretendemos optimizar um método colorimétrico económico para a detecção
rápida de β-lactamases AmpC, β-lactamases de largo espectro (ESBLs), metallo-β-lactamases (MBLs), e
carbapenemases, bem como a detecção simultânea de actividade de efluxo em E. coli para uso de rotina.
As 27 estirpes clínicas de E. coli estudadas foram genotipadas por ERIC-PCR. A susceptibilidade aos
antibióticos foi avaliada por Kirby-Bauer. As concentrações mínimas inibitórias (CMIs) dos β-lactâmicos foram
determinadas na presença e ausência dos seguintes inibidores específicos de β-lactamases: cloxacillina para
AmpC; clavulanato para ESBLs; EDTA para MBLs e ácido borónico para carbapenemases. As CMIs dos βlactâmicos foram também realizadas na presença e ausência dos inibidores de efluxo clorpromazina, “phearg-β-naphthylamide” (PAβN) e “carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone” (CCCP) em combinação com
os inibidores de β-lactamases. As CMIs foram efectuadas usando o método de microdiluição em placa de 96
poços e MTT para detecção colorimétrica. Os resultados foram validados usando os métodos fenotípicos
padrão para detecção de β-lactamases por difusão em disco e a detecção de genes que codificam βlactamases.
A produção de β-lactamasesfoi detectada em todas as estirpes clínicas e incluiu a presença de AmpC,
TEM com OXA-1, SHV, ou CTX-M ou sobrexpressão de AmpC. Foi possível reduzir as CMIs dos β-lactâmicos
na presença dos inibidores de efluxo em combinação com os inibidores de β-lactamases demonstrando que,
apesar da presença de β-lactamases, as CMIs dos β-lactâmicos podem ser reduzidas na presença de
inibidores de efluxo.
Neste trabalho, optimizámos um método para a detecção simultânea de β-lactamases AmpC, ESBLs,
MBLs, carbapenemases e actividade de efluxo. Este método apresenta potencialidade para ser usado em
países em desenvolvimento uma vez que é um método de fácil execução e não necessita de reagentes
dispendiosos nem de equipamento especializado. Quando associado ao uso de um composto colorimétrico
para a detecção, como o MTT, a interpretação dos resultados é directa uma vez que não está dependente do
operador, evitando deste modo resultados falso-negativos bem como falsos-positivos.
Baseado nos resultados obtidos, o efeito sinérgico observado entre inibidores de β-lactamases e
inibidores de efluxo sugere um aumento da concentração de β-lactâmicos no interior da célula, aumentando
assim a sua acção bactericida.
Development of a Gold Nanoparticle-Based Lateral-Flow Immunoassay for Pneumocystis Pneumonia Serological Diagnosis at Point-of-Care
Publication . Tomás, Ana Luísa; de Almeida, Miguel P.; Cardoso, Fernando; Pinto, Mafalda; Pereira, Eulália; Franco, Ricardo; Matos, Olga; DQ - Departamento de Química; Instituto de Higiene e Medicina Tropical (IHMT); TB, HIV and opportunistic diseases and pathogens (THOP); Global Health and Tropical Medicine (GHTM); UCIBIO - Applied Molecular Biosciences Unit; Frontiers Research Foundation
Pneumocystis jirovecii pneumonia (PcP) is a major human immunodeficiency virus (HIV)-related illness, rising among immunocompromised non-HIV patients and in developing countries. Presently, the diagnosis requires respiratory specimens obtained through invasive and costly techniques that are difficult to perform in all patients or implement in all economic settings. Therefore, the development of a faster, cost-effective, non-invasive and field-friendly test to diagnose PcP would be a significant advance. In this study, recombinant synthetic antigens (RSA) of P. jirovecii’s major surface glycoprotein (Msg) and kexin-like serine protease (Kex1) were produced and purified. These RSA were applied as antigenic tools in immunoenzymatic assays for detection of specific anti-P. jirovecii antibodies (IgG and IgM) in sera of patients with (n = 48) and without (n = 28) PcP. Results showed that only IgM anti-P. jirovecii levels were significantly increased in patients with PcP compared with patients without P. jirovecii infection (p ≤ 0.001 with both RSA). Thus, two strip lateral flow immunoassays (LFIA), based on the detection of specific IgM anti-P. jirovecii antibodies in human sera samples, were developed using the innovative association of P. jirovecii’s RSA with spherical gold nanoparticles (AuNPs). For that, alkanethiol-functionalized spherical AuNPs with ca. ~40 nm in diameter were synthetized and conjugated with the two RSA (Msg or Kex1) produced. These AuNP-RSA conjugates were characterized by agarose gel electrophoresis (AGE) and optimized to improve their ability to interact specifically with serum IgM anti-P. jirovecii antibodies. Finally, two LFIA prototypes were developed and tested with pools of sera from patients with (positive sample) and without (negative sample) PcP. Both LFIA had the expected performance, namely, the presence of a test and control red colored lines with the positive sample, and only a control red colored line with the negative sample. These results provide valuable insights into the possibility of PcP serodiagnosis at point-of-care. The optimization, validation and implementation of this strip-based approach may help to reduce the high cost of medical diagnosis and subsequent treatment of PcP both in industrialized and low-income regions, helping to manage the disease all around the world.
Uma abordagem bioinformática para o estudo da contribuição das bombas de efluxo “Small Multidrug Resistance” na resistência aos antibióticos em Acinetobacter baumannii através da análise de genoma completo
Publication . Ribeiro, José Francisco Valente; Viveiros, Miguel; Machado, Diana
RESUMO: As bombas de efluxo (BEs) da família “Small Multidrug Resistance” (SMR) encontram-se pouco caracterizadas em Acinetobacter baumannii. Estes transportadores estão implicados no efluxo de múltiplos compostos antimicrobianos, principalmente compostos orgânicos catiónicos. Neste trabalho, pretendemos identificar BEs do tipo SMR em A. baumannii através da análise da sequência do genoma completo e compará-lo com os de outras espécies bacterianas, analisando as possíveis implicações na resistência antimicrobiana nesta espécie.
A análise bioinformática foi realizada usando genomas anotados de A. baumannii publicados na base de dados do NCBI. A pesquisa das proteínas candidatas e os ortólogos correspondentes em outras bactérias foi realizada usando a base de dados do NCBI e KEGG. A análise da similaridade entre as sequências de aminoácidos das proteínas encontradas foi efectuada usando o algoritmo BLASTP. A categorização funcional dos subsistemas de sequências de DNA codificante (CDS) e a sua visualização foi determinada com o programa SEED. O arranjo genómico dos genes ortólogos foi analisado usando o programa SyntTax. As representações circulares do genoma das estirpes de referência de A. baumannii foi obtida recorrendo ao programa GCView.
Identificámos três BE SMR codificadas no cromossoma - AbeS, EmrE e SugE - e três codificadas em plasmídeos ou integrões de classe 1 - QacF, QacE e QacEΔ1. Destas, apenas as BEs AbeS, QacE e QacEΔ1 se encontram estudadas e associadas à resistência a compostos antimicrobianos em A. baumannii. Verificamos que as BE cromossómicas estão presentes em todos os grupos clonais de A. baumannii, enquanto apenas alguns possuem BEs codificadas em elementos móveis. As BEs encontradas neste trabalho apresentam elevado nível de similaridade (> 70%) ao nível da sequência de aminoácidos com BEs do tipo SMR presentes noutras espécies bacterianas.
A presença de várias BEs do tipo SMR no genoma de A. baumannii pode explicar a elevada predisposição de A. baumannii para sobreviver na presença de compostos orgânicos catiónicos, como desinfectantes, biocidas e corantes. A identificação de proteínas ortólogas do tipo SMR no genoma de A. baumannii sugere um papel semelhante na resistência antimicrobiana. A abordagem in silico baseada na análise de sequências de genomas completos poderá ser útil para identificar características fenotípicas relevantes, para diversos compostos antimicrobianos, incluindo antibióticos.
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Fundação para a Ciência e a Tecnologia
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5876
Número da atribuição
UID/Multi/04413/2013