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Dry powder formulations containing bioactive compounds from marine Actinobacteria
Publication . Almeida, Vanessa Clemente; Aguiar-Ricardo, Ana
Lower respiratory infections were the leading cause of sickness and mortality in 2013.1 The treatment of such infections relies on antibiotic therapy. However, antibiotic resistance to human pathogens and the prevalence of new cancer types continues to increase, so it is imperative not only to discover new lead-like drugs agents, but also develop new drug delivery systems for pulmonary diseases.2,3 In order to achieve such goal, it was isolated and elucidated antibacterial compounds from a marine-sediment-derived Actinobacteria, collected along Madeira archipelago. These bioactive compounds were obtained from Streptomyces aculeolatus, PTM-029, belonging to the MAR4 group. The structures of these compounds were elucidated by 1D and 2D NMR, HR-MS and other spectroscopic data. The antibacterial activity against methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) and vancomycin-resistant Enterococcus faecium EF82 (VRE) were determined for the most promising compound isolated from PTM-029, with a minimum inhibitory concentration (MIC) of 1,95 μg/mL for both bacterial pathogens. Subsequently, chitosan and cholesterol-based dry powder formulations were manufactured, containing encapsulated POxylated polymer, efficiently synthesized using a supercritical-assisted polymerization in carbon dioxide (CO2), end-capped to a model drug ibuprofen (IBP) and a marine bioactive compound, PTM-029, F4, F39. The dry powder formulations (DPF) were then synthesized through the Supercritical Assisted Spray-Drying (SASD) technique. All the produced DPFs were characterized in detail in relation to their morphology, physical-chemical properties and aerodynamic performance. The resulting particles showed good aerodynamic diameters between the 1 and 7 μm, yields up to 45% and FPF percentages rounding the 71%, as well as the required morphology to make them suitable for pulmonary delivery.
Avaliação da atividade anti-biofilme de produtos naturais isolados de actinobactérias marinhas para o desenvolvimento de uma tinta antifouling
Publication . Macedo, Helena Isabel de Lemos; Gaudêncio, Susana; Sobral, Rita
Estudo preliminar do metaboloma e proteoma de estirpes da actinobactéria marinha Streptomyces aculeolatus
Publication . Fernandes, Ana Filipa Barcelos; Gaudêncio, Susana; Almeida, Maria Gabriela
As actinobactérias marinhas têm vindo a ser exploradas como fontes de novos compostos bioativos, apresentando estruturas e atividades biológicas distintas das actinobactérias terrestres. Neste contexto, pretendeu-se estudar duas estirpes pertencentes à espécie Streptomyces aculeolatus (PTM-346 e PTM-398) provenientes de sedimentos marinhos recolhidos no arquipélago da Madeira. Esta espécie pertence ao grupo MAR4 tendo como característica principal a produção de isoprenóides híbridos (napiradiomicinas, marinonas, lavanducianinas e nitropirrolinas).
Numa primeira fase do trabalho, separaram-se os metabolitos secundários produzidos pela estirpe PTM-398 por cromatografia flash e por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), onde se obtiveram 164 compostos. De forma a avaliar a atividade antimicrobiana destes compostos contra bactérias patogénicas Staphylococcus aureus COL resistente à meticilina (MRSA, Methicillin Resistant Staphylococcus aureus) e Enterococcus faecium EF82 resistente à vancomicina (VRE, Vancomycin Resistant Enterococci), foram realizados ensaios antimicrobianos preliminares a 138 dos metabolitos secundários isolados. Estes apresentaram, no geral, baixa atividade antimicrobiana. Os dois compostos mais promissores apresentaram concentrações mínimas inibitórias (MIC) para MRSA COL de 7,81 μg/mL e para VRE EF82 de 3,91 μg/mL. Verificou-se ainda que a estirpe PTM-346 produziu predominantemente marinonas e que a estirpe PTM-398 produziu maioritariamente napiradiomicinas.
Por outro lado, procurou-se caracterizar as proteínas envolvidas na biossíntese dos compostos bioativos destas duas estirpes. Como tal, numa segunda fase deste trabalho, os extratos proteicos totais das estirpes foram analisados por eletroforese bidimensional (2DE), num gradiente de pH 4 - 7. Foram detetados 738 e 866 spots de proteínas nos géis de células das estirpes PTM-346 e PTM-398, respetivamente. Pela avaliação estatística foi possível observar 173 spots diferenciais, dos quais 110 se encontravam sobre-expressos na estirpe PTM-346 e 63 na estirpe PTM-398. Estes resultados foram relacionados tendo em conta a diversidade filogenética e as eventuais diferenças genómicas entre os dois microrganismos.
Estudo comparativo dos proteomas extra e intracelular das actinobactérias Streptomyces aculeolatus PTM-29 e PTM-129
Publication . Costa, Lígia Francisca Rodrigues; Almeida, Maria Gabriela; Gaudêncio, Susana
As actinobactérias marinhas, particularmente a linhagem MAR4, um novo grupo de actinobactérias relacionadas ao género Streptomyces, tem se revelado uma fonte rica de isoprenóides híbridos, uma vasta família de metabolitos com um largo espetro de bioatividades. A integração de tecnologias Omics, como genómica, proteómica, transcriptómica e metabolómica, têm desempenhado um papel fundamental no acesso ao potencial de produção destes microrganismos, permitindo o entendimento das vias moleculares envolvidas na biossíntese de metabolitos.
Neste trabalho adotou-se uma abordagem proteómica diferencial, baseada em 2DE, para o estudo comparativo dos proteomas de duas estirpes de actinobactérias marinhas da linhagem MAR4 pertencentes à espécie Streptomyces aculeolatus. Codificadas por PTM-29 e PTM-129 estas estirpes partilham 99% de identidade com base na sequência do gene 16S rRNA. Contudo, as estirpes exibem grandes diferenças ao nível do seu metaboloma e, consequentemente, ao nível do seu perfil de bioatividade, sendo que a PTM-29 está envolvida na síntese de napiradiomicinas e marinonas com atividades antimicrobianas contra MRSA COL (Staphylococcus aureus resistente à meticilina) e VRE EF82 (Enterococcus resistente a vancomicina) enquanto que a PTM-129 não exibiu, até à data, qualquer tipo de bioatividade. Assim, estabeleceu-se a estirpe PTM-129, como a estirpe de referência, com o objetivo de se identificarem biomarcadores proteicos da síntese de metabolitos excretados pela estirpe PTM-29. Adicionalmente, realizou-se um estudo aos exoproteomas das referidas estirpes, utilizando a mesma abordagem, com o objetivo de se identificarem novos metabolitos bioativos, nomeadamente péptidos não ribossomais, frequentemente sintetizados por estes microrganismos. Os proteomas foram analisados num intervalo de pH 4-7, e a recolha das células das referidas estirpes, para os estudos proteómicos, foi efetuada durante a fase estacionária do crescimento, uma vez que esta potencia o metabolismo secundário e, por conseguinte, a expressão das proteínas biossintéticas.
Os proteomas totais das estirpes PTM-29 e PTM-129, apresentaram padrões de expressão semelhantes, com 203 spots comuns. No entanto, por outro lado, foi detetado um grande número de spots exclusivos de cada uma das estirpes, que representam possíveis candidatos a biomarcadores da síntese dos metabolitos encontrados no metaboloma da estirpe PTM-29. No que diz respeito aos exoproteomas, as estirpes em estudo apresentaram perfis bastante distintos, com apenas 25 spots comuns e um grande número de spots exclusivos de cada estirpe. A grande diversidade de espécies proteicas observadas ao nível dos exoproteomas constitui uma boa oportunidade de investigação para o screening de novos metabolitos bioativos. Neste contexto, o potencial antimicrobiano destes extratos foi testado contra duas bactérias multirresistentes a MRSA COL e VRE EF82, e resultados preliminares revelaram bioatividade das estirpes PTM-29 e PTM-129 contra MRSA, com valores de MIC de 62,5 μɡ/mL e 125 μɡ/mL, respetivamente.
Novos compósitos poliméricos derivados de produtos naturais marinhos com atividade antimicrobiana contra MRSA
Publication . Silva, Sofia Isabel Batista da; Gaudêncio, Susana; Almeida, Pedro
Staphylococcus aureus é uma bactéria patogénica oportunista responsável por diversas doenças e associada a um elevado nível de morbilidade e de mortalidade. A sua capacidade para adquirir resistência aos antibióticos, o seu elevado número de fatores de virulência e a sua competência para formar biofilmes faz deste micro-organismo um enorme problema de saúde pública.
Face à escassez de agentes antimicrobianos, a descoberta de novos produtos naturais bioativos é fundamental para o combate desta problemática. As actinobactérias marinhas têm-se revelado uma fonte promissora de compostos com atividade anti-biofilme e antimicrobiana.
Este trabalho teve dois objetivos relacionados mas distintos. Numa primeira abordagem, identificar novos compostos com atividade anti-biofilme contra estirpes de S. aureus (NCTC 8325, WIS, MW2 e HDE288). Para tal, foram testados 7 extratos brutos e 49 compostos puros provenientes de actinobactérias marinhas, dos quais 11 compostos puros revelaram atividades promissoras.
A segunda abordagem foi desenvolver um compósito polimérico para a aplicação em feridas infetadas por MRSA ou como tratamento profilático para queimaduras através da incorporação de compostos com atividade antimicrobiana. Para tal, utilizaram-se dois polímeros, a hidroxipropilcelulose (solúvel em água) e o acetato de celulose (insolúvel em água), nos quais se incorporou o composto comercial tetraciclina. As soluções poliméricas foram depositadas segundo duas técnicas diferentes: técnica da deposição de filmes por espalhamento e electrofiação.
Com base nos resultados obtidos por ensaios de halos de inibição verificou-se uma menor inibição para o filme de AC com tetraciclina em comparação com os discos de tetraciclina comerciais. Em contraste, o filme de HPC resultou numa inibição superior do crescimento bacteriano, este facto aliado à sua solubilidade em água permite que este possa ser utilizado no desenvolvimento de um compósito polimérico indolor. Assim sendo, incorporou-se o composto PTM-420;F2+F3;F35 na solução polimérica de HPC com o intuito de determinar a sua atividade antimicrobiana quando associado ao polímero. Devido a diferenças de solubilidade do compósito polimérico/composto, não foram obtidos resultados de inibição da mesma ordem de grandeza dos obtidos para o filme de HPC com tetraciclina. Para otimizar o sistema incorporou-se o composto PTM-29;F4;F39, menos apolar e com maior afinidade para o polimero. No entanto, o nível de inibição obtido foi semelhante ao composto PTM-420;F2+F3;F35, podendo o fenómeno estar associado com a difusão do composto e a dissolução do polimero. A velocidade de solubilização pode ser benéfica para aplicação do sistema compósito polimérico/composto no tratamento de feridas onde se pretende que o composto seja libertado ao logo do tempo. Futuramente, serão estudados estes parâmetros.
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Entidade financiadora
Fundação para a Ciência e a Tecnologia
Programa de financiamento
3599-PPCDT
Número da atribuição
PTDC/QUI-QUI/119116/2010