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Projeto de investigação
Strategic Project - UI 457 - 2011-2012
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Estudo comparativo dos proteomas extra e intracelular das actinobactérias Streptomyces aculeolatus PTM-29 e PTM-129
Publication . Costa, Lígia Francisca Rodrigues; Almeida, Maria Gabriela; Gaudêncio, Susana
As actinobactérias marinhas, particularmente a linhagem MAR4, um novo grupo de actinobactérias relacionadas ao género Streptomyces, tem se revelado uma fonte rica de isoprenóides híbridos, uma vasta família de metabolitos com um largo espetro de bioatividades. A integração de tecnologias Omics, como genómica, proteómica, transcriptómica e metabolómica, têm desempenhado um papel fundamental no acesso ao potencial de produção destes microrganismos, permitindo o entendimento das vias moleculares envolvidas na biossíntese de metabolitos.
Neste trabalho adotou-se uma abordagem proteómica diferencial, baseada em 2DE, para o estudo comparativo dos proteomas de duas estirpes de actinobactérias marinhas da linhagem MAR4 pertencentes à espécie Streptomyces aculeolatus. Codificadas por PTM-29 e PTM-129 estas estirpes partilham 99% de identidade com base na sequência do gene 16S rRNA. Contudo, as estirpes exibem grandes diferenças ao nível do seu metaboloma e, consequentemente, ao nível do seu perfil de bioatividade, sendo que a PTM-29 está envolvida na síntese de napiradiomicinas e marinonas com atividades antimicrobianas contra MRSA COL (Staphylococcus aureus resistente à meticilina) e VRE EF82 (Enterococcus resistente a vancomicina) enquanto que a PTM-129 não exibiu, até à data, qualquer tipo de bioatividade. Assim, estabeleceu-se a estirpe PTM-129, como a estirpe de referência, com o objetivo de se identificarem biomarcadores proteicos da síntese de metabolitos excretados pela estirpe PTM-29. Adicionalmente, realizou-se um estudo aos exoproteomas das referidas estirpes, utilizando a mesma abordagem, com o objetivo de se identificarem novos metabolitos bioativos, nomeadamente péptidos não ribossomais, frequentemente sintetizados por estes microrganismos. Os proteomas foram analisados num intervalo de pH 4-7, e a recolha das células das referidas estirpes, para os estudos proteómicos, foi efetuada durante a fase estacionária do crescimento, uma vez que esta potencia o metabolismo secundário e, por conseguinte, a expressão das proteínas biossintéticas.
Os proteomas totais das estirpes PTM-29 e PTM-129, apresentaram padrões de expressão semelhantes, com 203 spots comuns. No entanto, por outro lado, foi detetado um grande número de spots exclusivos de cada uma das estirpes, que representam possíveis candidatos a biomarcadores da síntese dos metabolitos encontrados no metaboloma da estirpe PTM-29. No que diz respeito aos exoproteomas, as estirpes em estudo apresentaram perfis bastante distintos, com apenas 25 spots comuns e um grande número de spots exclusivos de cada estirpe. A grande diversidade de espécies proteicas observadas ao nível dos exoproteomas constitui uma boa oportunidade de investigação para o screening de novos metabolitos bioativos. Neste contexto, o potencial antimicrobiano destes extratos foi testado contra duas bactérias multirresistentes a MRSA COL e VRE EF82, e resultados preliminares revelaram bioatividade das estirpes PTM-29 e PTM-129 contra MRSA, com valores de MIC de 62,5 μɡ/mL e 125 μɡ/mL, respetivamente.
Genetic and biochemical characterization of hemicellulose polysaccharides utilization in Bacillus subtilis
Publication . Ferreira, Mário José Rodrigues; Nogueira, Isabel
Plant biomass is the major source of available carbohydrates in Nature. The walls of plant cells are mainly composed by homo- and heteropolysaccharides, usually found intertwined with each other and making a highly complex and heterogeneous structure, which displays a strong resistance to biological degradation. Still, many microorganisms are able to breakdown this complex structure and use the available sugars as carbon and energy source. Several saprophytic bacteria, including Bacillus subtilis, release a high number of saccharolytic enzymes capable of cleaving most polysaccharides in plant cell walls, and are then able to transport and metabolize the resulting mono- and oligosaccharides. Thus, transport is a key step in sugar utilization. Here, we characterize four ABC-type transporters involved in the uptake of arabino- and galactooligosaccharides, and galacturonic acid oligomers and/or rhamnose-galacturonic acid disaccharides. We show that MsmX is the sole ATPase responsible for energizing these four ABC importers, thus playing a key role in pectin mobilization by B. subtilis. AraN, the solute-binding protein (SBP) from the ABC importer, AraNPQ, is shown by in vivo and in vitro analyses to bind arabinooligosaccharides. However, AraN displays a significantly lower affinity than that previously reported for other SBPs. In addition, AraN also binds cello-, xylo- and maltooligosaccharides with similar affinity but is shown to be non-essential for growth in the presence of these oligosaccharides. We speculate that binding of these sugars may prevent arabinooligosaccharides uptake when more favorable carbon sources, such as glucose-rich cello- and maltodextrins, are available. The mechanisms of expression of abn2, a gene encoding an endo-arabinanase, were investigated and we provide evidence that this AraR-independent gene is temporally regulated. The transition state regulator AbrB and the master sporulation regulator Spo0A are implicated in the regulation of abn2. Finally, we demonstrate that a metallic cluster close to the catalytic site of Abn2 is essential for its arabinanase activity.
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Fundação para a Ciência e a Tecnologia
Programa de financiamento
6817 - DCRRNI ID
Número da atribuição
PEst-OE/BIA/UI0457/2011