Utilize este identificador para referenciar este registo: http://hdl.handle.net/10362/56799
Título: Contribuição para o estudo de infecção por Treponema pallidum subespécie pallidum: resposta serológica, diagnóstico molecular e genotipagem
Autor: CASTRO, Rita
Orientador: ESTEVES, Aida
MONTEIRO, Carolino
Palavras-chave: Microbiologia médica
Doenças sexualmente transmitidas
Treponematoses
Treponema pallidum
Sífilis
Serologia
Genotipagem
Epidemiologia
Taxonomia
Genoma
Diagnóstico
Terapêutica
Data de Defesa: 2004
Editora: Instituto de Higiene e Medicina Tropical
Resumo: A sífilis é uma doença sexualmente transmitida, reconhecida como tal desde o século XVI, cujo agente etiológico é Treponema pallidum subespécie pallidum, para o qual não existe meio de cultura artificial. Sendo uma infecção com inúmeras manifestações clínicas, incluindo a fase de latência e não havendo uma técnica que possa ser um verdadeiro teste padrão, o seu diagnóstico clínico e laboratorial afigura-se muitas vezes difícil. Nesta tese foram avaliados vários testes Venereal Disease Research Laboratory (VDRL), Rapid Plasma Reagin Test (RPR), Treponema pallidum Hemaglutination Antibody (TPHA), Fluorescent Treponemal Antibody Absortion (FTA-Abs), Passive Particle Agglutination Test (TP.PA), teste imunoenzimática (SYPHILIS-EIA) e Western-blot para a pesquisa de anticorpos anti-Treponema pallidum e técnicas de biologia molecular reacção em cadeia da polimerase (PCR) para o diagnóstico da sífilis nos seus diferentes estádios, incluindo neurossífilis. Experimentaram-se várias sequências iniciadoras (47-F/47-R, polA-F/polA-R-(PE), KO3A/KO4 e polA-F/polA-R) para amplificação de fragmentos dos genes da lipoproteína de 47kDa e do ADN polimerase I, e diferentes tipos de amostras: exsudado de úlceras genitais e de lesões cutâneas de secundarismo, exsudado de biopsias do lóbulo da orelha, sangue total, plasma, soro e liquor. Foram também optimizadas técnicas de PCR para a genotipagem de Treponema pallidum (amplificação de um fragmento do gene tpr e do gene arp) as quais foram aplicadas em algumas amostras incluídas neste estudo. Com a técnica de RPR obtiveram-se resultados idênticos ao VDRL no sangue e no liquor, pelo que parece que ambas as técnicas podem ser indiscriminadamente utilizadas nos dois tipos de produtos. Com os testes treponémicos obtiveram-se também, resultados semelhantes no liquor e no sangue. No entanto, as diferenças encontradas indicam que: a) o FTA-Abs, o Western-blot e o TP.PA devem ser os testes a utilizar nas fases precoces da infecção; b) o teste EIA parece indicado no caso de um grande número de amostras; c) o TP.PA e o TPHA podem ser utilizados na rotina laboratorial e, o primeiro eventualmente, também, na monitorização da terapêutica; d) o FTA-Abs e o Western-blot são os testes treponémicos que, de preferência devem ser utilizados no diagnóstico de neurossífilis embora os resultados do TP.PA se comparem aos do TPHA, no caso da infecção do sistema nervoso central por Treponema pallidum. A co-infecção com o VIH parece, ter efeito apenas, na reactividade dos testes não treponémicos, ocasionando falsa reactividade, independentemente da existência simultânea de toxicodependência. Em relação à técnica de PCR para o diagnóstico de sífilis, e para as várias sequências iniciadoras experimentadas os melhores resultados obtiveram-se com o par KO3A/KO4. A sensibilidade da técnica de PCR e de genotipagem nas amostras das úlceras genitais e das lesões cutâneas de sífilis secundária foi de 100%, o mesmo não acontecendo quando as técnicas se aplicaram à identificação de Treponema pallidum no sangue e no liquor, pelo que a técnica de PCR aplicada a este tipo de amostras necessita de ser aperfeiçoada. No entanto o exsudado de biopsia do lóbulo da orelha, seguida do plasma são os produtos, em que mais vezes, se identificou ADN de Treponema pallidum. O genótipo de Treponema pallidum subespécie pallidum mais frequentemente encontrado foi o 14c, sendo que o genótipo 10a foi pela primeira vez identificado no presente estudo.
Syphilis is a sexually transmitted disease, which has been recognized since the 16th century. T. pallidum subspecies pallidum is the etiological agent, for which there is no artificial culture media. As this infection has a variety of clinical manifestations, including a latent phase, and since there is no test that can be considered a true gold standard , it s clinical and laboratory diagnosis is sometimes rather difficult. In this thesis a number of laboratory tests for the detection the of antibodies against T. pallidum were evaluated Venereal Disease Laboratory (VDRL), Rapid Plasma Reagin (RPR), Treponema pallidum Hemaglutination Antibody (TPHA), Fluorescent Treponemal Antibody Absortion FTA-Abs), Treponema pallidum Passive Particle Agglutination Antibody (TPPA), EIA antibodies (SYPHILIS EIA) and Western blot. Molecular biology techniques were developed and optimised for the diagnosis of syphilis in different stages, including neurosyphilis. Different primers were evaluated (47-F/47-R, polA-F/polA-R-(PE), KO3A/KO4 e polA-F/polA-R) for the amplification of the 47kDa protein and DNA polimerase I gene fragments. Different types of samples were also studied - genital ulcers and skin lesions exudates, ear lobe biopsy, total blood, plasma, sera and cerebral spinal fluid (CSF) - in view of verifying in which of them the PCR technique would be more sensitive. The RPR results were identical to those obtained with the VDRL, both in blood and CSF. Therefore, it seems that the techniques can be used in either product. The results obtained with the different treponemal tests evaluated in this study were also quite similar in blood and CSF. However, some differences were found, which indicate that: a) the FTA-Abs, the Western blot and the TP.PA should be used to diagnose early phases of disease; b) the EIA test seems to be indicated when there is a high number of samples; c) the TPPA and the TPHA tests may be used in laboratory routine work and the first in following up patients; d) the FTA Abs and the Western blot are the treponemal tests that should be used preferentially for the diagnosis of neurosyphilis. On should also mentioned that the TPPA can also be used to diagnose Treponema pallidum central nervous system infection, since the results of this test were similar to those obtained with the TPHA. Co-infection with HIV seems to cause false positive results only in non - treponemal tests and that is independent of simultaneous existence of drug addiction. In relation to the PCR technique for the diagnosis of syphilis and for the different primers tried, the best results were obtained with the pair KO3/KO4. The sensitivity of both the PCR and the genotyping techniques was found to be high (100%) in genital ulcers and cutaneous lesions exudates. The same does not apply when these techniques were used in blood and cerebrospinal fluid, although when ear lobe biopsy and plasma samples were used, T. pallidum DNA was identified more often. The most frequently T. pallidum subspecies pallidum genotype found was the 14c. To our knowledge, genotype 10a was identified for the first time in this study.
URI: http://hdl.handle.net/10362/56799
Designação: Doutoramento em Ciências Biomédicas
Aparece nas colecções:IHMT: MM - Teses de Doutoramento

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