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Título: Expressão em Escherichia coli da proteína Nef do vírus da imunodeficiência humana tipo 1 (VIH-1) como produto de fusão com a lipoproteína Oprl da Membrana externa de pseudomonas aeruginosa e indução da imunidade humoral anti-Nef em modelo animal
Autor: PIEDADE, João Mário Brás da
Orientador: FERREIRA, Wanda Canas
Palavras-chave: Virologia
Doenças infecciosas
HIV
Sida
Proteínas
NEF
Lipoproteínas
Doenças infecciosas
SIDA
Proteínas
NEF
Data de Defesa: 2003
Editora: Instituto de Higiene e Medicina Tropical
Resumo: A proteína Nef do vírus da imunodeficiência humana tipo 1 (VIH-1) é uma proteína miristilada, de 27 kDa, expressada em níveis elevados imediatamente após a infecção. Embora seja dispensável para a replicação viral in vitro, Nef parece desempenhar um papel fundamental ao nível da patogénese viral in vivo. Entre as inúmeras funções biológicas que lhe são atribuídas, contam-se a estimulação da replicação viral, a indução do aumento da infecciosidade dos viriões, a modulação negativa da expressão superficial do receptor celular CD4 e do complexo principal de histocompatibilidade de classe I (MHC I), a modulação de inúmeras vias de sinalização celular/transdução de sinal em linfocitos T e a interferência no processo de indução da morte celular programada, protegendo da apoptose as células infectadas e induzindo-a nas células vizinhas não infectadas, incluindo linfocitos T CD8+ específicos para o VIH-1. Devido ao seu papel fundamental ao nível do ciclo replicativo viral, a proteína Nef foi considerada como um potencial alvo terapêutico e vacinal. Neste trabalho, o gene nef do VIH-1 foi amplificado por PCR a partir da linha celular 8E5/LAV (HIV-1) e clonado no sistema de expressão “transportador-adjuvante” pVUB3 (Cote-Sierra et al., 1998), baseado na lipoproteína OprI da membrana externa de Pseudomonas aeruginosa. Desta clonagem resultou a construção do plasmídio recombinante pVUB3nef8E5, de 4958 pb, a partir do qual se induziu a expressão da proteína de fusão OprI-Nef ao nível da membrana externa de Escherichia coli. A produção da proteína de fusão foi demonstrada por visualização de extractos proteicos de membrana externa em gel de poliacrilamida/SDS e confirmada por experiências de imunodetecção com anticorpos anti-OprI e anti-Nef. Com o objectivo de obter extractos da proteína de fusão com um grau de pureza elevado, um oligonucleótido 6xHis foi introduzido a jusante da construção híbrida oprI-nef de pVUB3nef8E5, no que resultou a formação do novo vector de expressão pVUB3nefB-6xHis (4944 pb). Após um processo de optimização das condições experimentais relativas à purificação, sob condições desnaturantes, da proteína de fusão OprI-Nef-6xHis por cromatografia de afinidade e um passo adicional de ultrafiltração, foi possível a obtenção de extractos proteicos finais com um grau de pureza relativamente elevado (análise em gel de poliacrilamida/SDS e por imunodetecção). Estes apresentaram uma concentração proteica aproximada de 4 μg/μl, correspondendo a um rendimento global do processo de purificação de cerca de 1,5 mg de proteína por litro de cultura bacteriana, e uma quantidade de lipopolissacáridos (endotoxinas) adequada à realização de experiências de imunização. A proteína de fusão OprI-Nef-6xHis foi utilizada como imunogénio em experiências de imunização em modelo murino, com o objectivo de se caracterizar a componente humoral da resposta imune anti-Nef, por comparação com a administração da proteína Nef em tampão PBS (rNef) e em adjuvante de Freund (rNef/AF). A imunização com a proteína de fusão induziu uma resposta humoral anti-Nef caracterizada por um título de diluição limite de anticorpos da classe IgG muito elevado (1:37300), significativamente superior ao obtido no grupo rNef, sem que a sua administração tivesse aparentemente qualquer tipo de efeitos secundários nos animais. Por outro lado, comparativamente aos grupos rNef e rNef/AF, observou-se um desvio da resposta imune no sentido Th1, facto relevante no caso da infecção pelo VIH. Este fenómeno, bem com a indução de um título elevado de anticorpos anti-Nef da classe IgG, dever-se-á, muito provavelmente, à presença da componente lipídica na proteína de fusão. Finalmente, a utilização da proteína de fusão OprI-Nef-6xHis como antigénio em experiências de ELISA permitiu detectar anticorpos anti-Nef em 77% dos soros testados de indivíduos infectados com o VIH, indicando que a proteína híbrida obtida, embora purificada de um modo desnaturante, manterá epitopos de Nef sob uma forma imunologicamente relevante. Os resultados obtidos apontam ainda para um reconhecimento imune alargado destes epitopos por anticorpos naturais anti-Nef produzidos contra diferentes genótipos do VIH-1, e, muito provavelmente, mesmo contra o VIH-2, o que parece substanciar a utilização desta proteína de fusão como potencial imunogénio anti-VIH. Em conclusão, o sistema de expressão pVUB3 parece constituir um modelo promissor para a produção heteróloga, em bactérias Gram-negativas, de lipoproteínas de fusão contendo determinantes antigénicos de proteínas dos vírus da imunodeficiência humana, a serem eventualmente incluídas como agentes de imunização em esquemas experimentais de vacinação anti-VIH.
The human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) Nef protein is a 27 kDa myristylated early protein, expressed immediately after infection at relatively high levels. Although not necessary for viral replication in vitro, it has been shown to be a major determinant for AIDS pathogenesis. Nef can exert several effects at the cellular level: enhancement of viral replication and virion infectivity, downregulation of the cell-surface expression of CD4 and MHC class I molecules, modulation of T cell signal transduction pathways and regulation of programmed cell death (protecting infected cells from apoptosis and leading to bystander cell killing, including of HIV-specific cytotoxic T lymphocytes). Therefore, Nef has been considered a valuable target for the development of novel antiviral therapies and/or vaccines. In this work, HIV-1 nef gene from 8E5/LAV (HIV-1) cell line was cloned into the carrier-adjuvant plasmid system pVUB3 (Cote-Sierra et al., 1998), based on the major lipoprotein (OprI) from the outer membrane of Pseudomonas aeruginosa. This resulted in the construction of the 4958-bp recombinant plasmid pVUB3nef8E5, which allowed the inducible production of an outer membrane-bound OprI-Nef fusion protein in Escherichia coli. The expression of OprI-Nef was firstly demonstrated by SDS-PAGE and further confirmed by Western blotting with anti-OprI and anti-Nef antibodies. In order to obtain high purity OprI-Nef extracts, a 6xHis tag was introduced downstream of oprI-nef in pVUB3nef8E5, which resulted in the construction of the expression vector pVUB3nefB-6xHis. The expression of the new inducible fusion protein (OprI-Nef-6xHis) was confirmed by SDS-PAGE and immunoblotting, being the protein purified under denaturing conditions by immobilised metal affinity chromatography, followed by ultrafiltration. The purified final extracts had a protein concentration of 4 μg/μl, corresponding to a global purification yield of 1,5 mg of protein/litre of bacterial culture, and low levels of endotoxins, adequate for immunization experiments. Aiming at the characterization of humoral immune responses induced by immunization with Nef as a fusion protein with OprI, three groups of mice were immunized, respectively, with OprI-Nef-6xHis, Nef in the presence of Freund’s adjuvant or Nef alone in PBS. Mice immunized with the fusion protein developed high levels of IgG anti-Nef antibodies (endpoint titre of 1:37,300), which was significantly higher than in mice immunized with the protein alone, with no visible adverse side effects for the inoculated animals. On the other hand, the analysis of the isotypic patterns of anti-Nef antibodies showed that immunization with Nef protein, with or without adjuvant, yielded a preponderance of IgG1 antibodies, indicating a predominant Th2 immune response, whereas OprI-Nef-6xHis immunization biased the humoral response towards IgG2a production, indicating the preferential induction of a Th1 immune response. As a whole, these results most probably reflect the in-built adjuvanticity and immune response modulation capacity of OprI-Nef-6xHis by virtue of its lipid moiety. Finally, an ELISA-based method for detection of anti-Nef antibodies in sera from HIV infected individuals was developed, using the fusion protein OprI-Nef-6xHis as coating antigen. On the overall, 77% of the tested sera were considered positive, irrespective of HIV-1 env genotypes and, probably, even of HIV type. This result shows that, despite of OprI-Nef-6xHis biochemical purification under denaturing conditions, there is a broad immune recognition of Nef epitopes in the fusion protein by natural anti-Nef antibodies, what seems to support its future use as an anti-HIV immunogen. In conclusion, the data obtained in this work indicate that pVUB3 constitutes an appropriate expression system for the heterologous production of bacterial fusion lipoproteins containing HIV antigenic determinants, to be potentially included in experimental anti-HIV immunization protocols.
URI: http://hdl.handle.net/10362/56798
Designação: Doutoramento em Ciências Biomédicas
Aparece nas colecções:IHMT: MM - Teses de Doutoramento

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3. Resumo.doc25,5 kBMicrosoft WordVer/Abrir
4. Abstract.doc24,5 kBMicrosoft WordVer/Abrir
5. Glossário.doc32,5 kBMicrosoft WordVer/Abrir
7. Dedicatória.doc19,5 kBMicrosoft WordVer/Abrir
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2. Agradecimentos.doc25 kBMicrosoft WordVer/Abrir


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