IHMT: PM - Teses de Doutoramento
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- Fasciolose em Portugal e no Brasil: diagnóstico e genotipagem nos hospedeiros definitivo e intermediárioPublication . D'ALMEIDA, Samira Carneiro Gomes; MAURÍCIO, Isabel Larguinho; MARTINS, Isabella Vilhena Freire; CALADO, Maria Manuela PalmeiroA fasciolose é uma helmintose cosmopolita causada por duas espécies de tremátodes, Fasciola hepatica e Fasciola gigantica, cujos hospedeiros intermediários são moluscos limneídeos e o reservatório são ruminantes. Esta parasitose é considerada reemergente pela OMS e é um dos fatores limitantes na produção em pasto de ruminantes, incluindo Brasil e Portugal. O controlo desta parasitose requer métodos de diagnósticos rápidos e precisos, e o conhecimento sobre as populações de moluscos hospedeiros se faz necessário. As técnicas de diagnóstico molecular são mais sensíveis que as parasitológicas, mas são necessários métodos para implementação em laboratórios com poucos recursos, como a técnica de Amplificação Isotérmica Mediada por Loop (LAMP) de DNA, que pode apresentar alta sensibilidade e especificidade. O presente trabalho se propôs desenvolver e testar a técnica de LAMP na deteção e genotipagem de F. hepatica em populações de hospedeiros bovinos e moluscos intermediários e verificar sua aplicação em campo, em amostras provenientes de Portugal e Brasil. Desenhou-se e implementou-se a técnica de LAMP com um novo conjunto selecionado de primers LAMP na região mitocondrial do gene NAD5, denominado Fh_1, para deteção específica de F. hepatica. O método LAMP, e a reação de PCR usando os primers externos, apresentou alta especificidade em amostras de DNA total de parasita adulto, fezes de ruminantes e em DNA extraído da região cefalopodal de moluscos, em relação a F. gigantica e outros helmintas. A sensibilidade em PCR foi de 10-4 ng e em LAMP de 10-2 ng de DNA, com um tempo para se obter o resultado de 3:00 h por PCR e 1:12 h por LAMP. De 222 moluscos Lymnaeidae, dos 1049 colhidos no distrito de Setúbal, confirmou-se infeção por F. hepatica em nove (4 %) através de PCR, e seis (1,8 %) por LAMP. Dos nove, seis foram identificados por métodos moleculares como Galba truncatula, principal hospedeiro intermediário de F. hepatica na Europa, um como a espécie gémea Galba schirazensis, e dois como Ampullaceana balthica. Avaliou-se o método de LAMP e PCR de NAD5 na deteção de F. hepatica em fezes bovinas em amostras de matadouro e numa manada tratada com albendazol no Brasil. Das 28 amostras de fezes recolhidas em matadouro, em Portugal e Brasil, com presença de parasitas adulto no fígado, quatro apresentaram ovos em exame parasitológico direto, mas 13 foram positivas através de PCR e três por LAMP. Nas amostras de manada antes e após tratamento, todas as 55 amostras de 11 bovinos foram positivas por PCR, mas, por LAMP, a infeção foi confirmada somente em 20% das amostras. Com os novos primers para amplificação por LAMP e PCR de NAD5 detetou-se DNA de F. hepatica com alta especificidade, e, apesar da sua menor sensibilidade, considerando a maior rapidez até ao resultado por LAMP que por PCR, LAMP poderá ser usado para detetar infeção por F. hepatica em populações de moluscos e bovinos no campo.
- Identificação e caracterização imunoquímica de antigénios de tripanosomatídeos envolvidos na reatividade serológica entre Trypanosoma cruzi e Leishmania spp.Publication . DONATO, Sílvia Tavares; SILVA, Marcelo Sousa; SANTOS-GOMES, GabrielaAs doenças tropicais negligenciadas, doença de Chagas e Leishmaniose Visceral, cujos agentes etiológicos são os protozoários Trypanosoma cruzi e Leishmania infantum, respectivamente, exibem distribuição geográfica sobreponível e endemicidades semelhantes em diversas áreas. Trypanosoma cruzi e Leishmania infantum pertencem à mesma família e compartilham repertórios de epítopos antigênicos com proteínas conservadas que podem ser responsáveis pela reatividade serológica cruzada no imunodiagnóstico da doença de Chagas e Leishmaniose Visceral. Reações serológicas cruzadas provocam alterações na precisão do imunodiagnóstico laboratorial destas doenças, podendo gerar distorções em inquéritos serológicos e estudos epidemiológicos. Este estudo realizou a caracterização antigénica e serológica cruzada em soros de indivíduos diagnosticados com a doença de Chagas e Leishmaniose Visceral. Por ELISA foi avaliada a seroreatividade antigénica de Trypanosoma cruzi e Leishmania infantum com a determinação do perfil serológico de anticorpos IgG totais anti Trypanosoma cruzi e anti-Leishmania infantum em amostras de soros de indivíduos com a doença de Chagas (n=240) ou Leishmaniose Visceral (n=240), respectivamente. A pesquisa da reatividade serológica cruzada foi feita por ELISA, quantificando anticorpos IgG totais anti-Trypanosoma cruzi em soros de Leishmaniose Visceral (n=240) e anticorpos IgG totais anti-Leishmania infantum em soros de doença de Chagas (n=240). Utilizou-se a técnica de immunoblotting para detetar frações proteicas de Trypanosoma cruzi e Leishmania infantum em soros de Leishmaniose Visceral e doença de Chagas, respectivamente. Anticorpos IgG totais anti-Trypanosoma cruzi foram detetados em 95,8% (230/240) de soros com doença de Chagas e anticorpos totais anti-Leishmania infantum foram detetados em 94,6% (227/240) de soros com Leishmaniose Visceral. Anticorpos IgG totais anti-Leishmania infantum foram detetados em 91,2% (219/240) de soros com doença de Chagas e anticorpos IgG totais anti-Trypanosoma cruzi foram detetados em 91,2% (219/240) de soros com Leishmaniose Visceral. Conclui-se que anticorpos anti-Trypanosoma cruzi reconhecem o antigénio Leishmania infantum tanto quanto anticorpos anti-Leishmania infantum reconhecem o antigénio Trypanosoma cruzi, em soros de indivíduos infetados com doença de Chagas e Leishmaniose Visceral. A pesquisa pela deteção de proteínas comuns aos parasitas analisados pode ser a diretriz para se chegar a um teste diagnóstico com a sensibilidade e especificidade desejadas e que não provoque seroreatividade cruzada entre o diagnóstico de doença de Chagas e Leishmaniose Visceral
- Bridging the gap between innate and adaptive immunity in dog leishmaniasisPublication . BOLAS, Ana Sofia Valério; SANTOS-GOMES, Gabriela; FONSECA, Isabel Pereira daA leishmaniose é um grupo de doenças causadas por diferentes espécies de Leishmania que afecta maioritariamente populações pobres de países subtropicais e tropicais e também animais selvagens e domésticos, como o cão. A leishmaniose canina (CanL) é uma doença endémica de preocupação mundial causada principalmente pelo protozoário L. infantum . O cão é um bom reservatório de L. infantum, uma vez que mantém a infeção durante muito tempo antes de desenvolver a doença facilitando a transmissão do parasita. Além disso, pensa-se que o cão também pode ser o reservatório de espécies americanas de Leishmania, como é o caso de L. amazonensis. A imunidade inata que é a primeira linha de defesa contra agentes patogénicos inclui células fagócitárias e células Natural Killer (NK). As células dendríticas (CD) têm a principal função de capturar agentes patogénicos e processar antigénios, desempenhando um papel crucial na proliferação e activação de células T, estabelecendo assim uma ponte entre a imunidade inata e a adquirida. As células NK influenciam o processo infeccioso através do reconhecimento e eventual destruição de células infectadas e da libertação de mediadores imunitários celulares que promovem microambientes inflamatórios. Considerando a reduzida informação existente sobre o papel das CD e das células NK durante a infeção por Leishmania, este estudo visou analisar in vitro a atividade das CD derivadas do sangue periférico (moCDs) canino e também abordar o papel das NK na resposta imunitária celular e a sua inter-relação com as moCDs. Após confirmação da diferenciação in vitro, as moCDs foram infectadas com L. infantum e L. amazonensis, e também expostas a vesículas extracelulares (EVs) libertadas por L. infantum (LiEVs) e L. amazonensis (LaEVs ). A infecção por L. infantum aumentou a expressão génica do receptor toll-like (TLR) 4 das moCDs em sinergia com a activação e translocação do factor nuclear (NF)-B para o núcleo e subsequente geração de citocinas pró-inflamatórias [interleucina (IL)-1β e IL-18]. Este parasita também induziu o predomínio da subpopulação de moCDs expressando moléculas de classe I do complexo maior de histocompatibilidade (MHCI) e aumentou a molécula de co-estimulação CD86 que, juntamente com a libertação da quimiocina CXCL16, poderá atrair e activar linfócitos T citotóxicos (CD8+) que podem causar a apoptose das células infetadas. Em contraste, L. amazonensis parece induzir moCDs anergicos, indicando que estes parasitas estabelecem diferentes relações imunitárias com as CDs, o que pode ser uma consequência da co-evolução parasita-hospedeiro. Os moCDs infectados com parasitas em co-cultura com células NK parecem promover a predominio da subpopulação de moDCs expressando moléculas de classe II do MHC, sugerindo a possibilidade de apresentação de antigénios às células T CD4+. Além disso, apesar da desgranulação das células NK e da libertação de perforina, não houve aumento da apoptose dos moCDs, e os parasitas internalizados pelos moCDs mostraram-se viáveis. Quando expostos a EVs, os moDCs também mostram diferenças na actividade imunitária. As LaEVs parecem sinalizar moCDs através de TLR2, causando a upregulação de CD80/CD86 e LiEVs promovem a expansão de moCDs MHCI+ aumentam a expressão génica de CD86. Ambas as EVs induziram a libertação de CXCL16, atraindo leucocitos. Os moCDs estimuladas por EVs induziram as células NK a gerar quimiocinas, atraindo outros leucócitos e promovendo a desgranulação que, no entanto, não induziam a apoptose dos moCDs. Quando em contacto com as células NK, os moDCs com LiEVs provocaram a expansão das subpopulações de MHCI+ e MHCII+ moCDs, enquanto as moCDs expostos a LaEVs mostraram aumento de moDCs MHCI+.Estes resultados indicam que as EVs podem modular a atividade imunitária das DC caninas. L.infantum e L.amazonensis, assim como as respetivas EVs, modulam a ativação das CD caninas, embora de formas diferentes. A compreensão detalhada das vias de ativação das CDs assim como a interação com as NK pode conduzir ao desenvolvimento de novas estratégias de controlo da leishmaniose.
- Leptospira spp. in Portugal: Epidemiological and molecular study in geographic areas with different urbanization levelsPublication . FERNANDES, Maria do Rosário Campos Oliveira; VIEIRA, Maria Luísa; TEODÓSIO, Rosa Maria FigueiredoA leptospirose é uma doença zoonótica infecciosa de importância global. Os roedores são os reservatórios mais comuns na disseminação de Leptospira spp.. Quando excretadas pela urina, as espiroquetas podem sobreviver por várias semanas ou meses, em condições favoráveis (solo húmido, água com pH neutro ou ligeiramente alcalino). Assim, a água e o solo contaminados tornam-se importantes veículos de transmissão para os humanos, os quais podem ser infetados pela penetração destes agentes infecciosos nas membranas mucosas intactas (nariz, boca, olhos), ou através da pele lesionada. Este estudo teve como objetivo avaliar a presença de Leptospira spp. em colecções de água doce, solos e roedores de três distritos de Portugal (Lisboa, Setúbal e Viseu). Foram recolhidas amostras de coleções de água doce distintas (superfície de lagos, lagoas, rios, riachos e fontes públicas) (ninverno=198; nverão=147), de solos (perto de coleções de água doce, latas de lixo ou áreas de vegetação) (n=104), em 15 cidades dos distritos de Lisboa, Setúbal e Viseu. Nos locais de colheita, foram avaliados alguns parâmetros químicos e físicos (por exemplo, pH, nitritos, temperatura), e registada a localização. Paralelamente às amostras ambientais, foram capturados roedores (N=35) na mesma região, para a análise molecular do sangue, urina e órgãos (rins, fígado, baço e pulmões), e cultura do tecido renal. Após a extração do DNA de todas as amostras, foram usados dois protocolos de nested-PCR com diferentes primers. Inicialmente, um protocolo de nested-PCR com primers universais do gene rrs (16S), para a detecção de Leptospira spp.. Cada amostra com amplificação de DNA de Leptospira spp. foi submetida a um segundo protocolo de nested-PCR, com primers específicos direcionados ao gene lipL32, para a deteção de espécies patogénicas de Leptospira. Um protocolo de PCR em tempo real usando primers “LipL32” foi também otimizado para a deteção de DNA de leptospiras patogénicas em amostras ambientais e de roedores (sangue total e baço), bem como para analisar a viabilidade das leptospiras em águas e solos. O protocolo de nested-PCR com primers universais permitiu a deteção de DNA leptospírico em 170 amostras de água (ninverno=116/198, 59%; nverão= 54/147, 37%) e em 88 amostras de solo (85%). Uma avaliação posterior com os primers "LipL32", permitiu a deteção de DNA de leptospiras patogénicas em 87 amostras de água (ninverno= 54/116, 47%; nverão= 33/54, 61%), em 11 amostras de solo (13%), e em 29 roedores capturados (83%). Os resultados da sequenciação demonstraram a presença de Leptospira interrogans e Leptospira borgpetersenii nas amostras ambientais, na urina e rins de roedores. Nenhum crescimento foi detetado nas culturas. Os testes de viabilidade realizados em certas amostras ambientais com DNA de leptospiras patogénicas, demonstraram que 44% (n= 4/9) continham leptospiras viáveis capazes de causar infeção em humanos.A amplificação de DNA leptospírico em mais da metade das amostras ambientais analisadas, e a evidência de que a maioria dos roedores capturados estão colonizados com leptospiras patogénicas, levanta uma importante evidência de saúde pública acerca do risco de transmissão para a população destas áreas geográficas.
- TickProVac: An insight into the Rhipicephalus sanguineus tick salivary gland proteome during Ehrlichia canis infection towards vaccine developmentPublication . GIBSON, Joana Isabel Figueira Ferrolho; DOMINGOS, Ana; FUENTE, José de La; BECHARA, GervásioAs carraças são reconhecidas como vectores de diversos agentes patogénicos responsáveis por doenças relevantes na medicina humana e animal. Erliquiose monocítica canina (EMC), causada pela bactéria Ehrlichia canis, é transmitida pela carraça Rhipicephalus sanguineus. O potencial zoonótico da EMC está bem documentado com relatos de infecções humanas em aumento permanente. A infestação por carraças e as doenças por elas transmitidas (DTCs) continuam a representar um sério problema devido à falta de profilaxias eficazes. É, portanto, imperativo adotar novas abordagens, nomeadamente a utilização de vacinas, para a redução de infestações por carraças e DTCs. Actualmente não existe vacina anti-R. sanguineus comercialmente disponível. De forma a solucionar esta lacuna, o objetivo principal do presente trabalho foi a caracterização de genes e proteínas que atuam na interface vector-agente patogénico na presença de infeção para compreender os mecanismos associados à transmissão de DTCs. Neste trabalho estão reportados genes e proteínas diferencialmente expressos obtidos a partir da análise transcriptómica e proteómica das glândulas salivares (GSs) de R. sanguineus durante a infeção com E. canis. Os níveis de expressão dos genes que codificam as proteínas serina carboxipeptidase (psc), proteína de choque térmico (phsrp20) e proibitina (prohib) foram investigados in vitro e in vivo, em amostras infectadas e não infectadas. Posteriormente, o silenciamento de genes foi realizado através de RNA de interferência (RNAi) para avaliar o efeito da sub-expressão de ferritina 1 na alimentação, desenvolvimento ovárico, oogénese e aquisição E. canis pela carraça. O mesmo foi efetuado para determinar o efeito da sub-expressão de psc, prohib e phsrp20 na invasão e multiplicação desta bactéria na linha celular IDE8 e em R. sanguineus. O péptido pPHSRP20, relacionado com o choque térmico, foi sintetizado para avaliar a sua imunogenicidade em ratos CD1. Os resultados mostraram que o silenciamento de ferritina 1 compromete a competência da carraça em se alimentar e provoca alterações morfológicas e histoquímicas nos ovários e oócitos. Os dados transcriptómicos e proteómicos demonstraram que as alterações da expressão génica e proteica estão principalmente relacionadas com processos proteicos celulares e metabólicos e com atividades catalíticas, muito provavelmente um reflexo de alterações de transcrição e tradução em resposta à presença de infecção. Em amostras infectadas verificou-se uma sub-expressão de phsrp20 e prohib em células IDE8 e de phsrp20 e psc nas GSs. Inversamente, os genes psc nas células IDE8 e prohib nas GSs estavam sobre-expressos. Apesar de se terem atingido níveis elevados de silenciamento, o seu efeito na biologia de E. canis não foi determinado devido a limitações moleculares. pPHSRP20 desencadeou uma resposta imunitária detectável e específica nos ratos CD1. Em geral, os resultados demonstraram que a presença de E. canis nas GSs desencadeia respostas celulares para regulação do stress, inflamação e rearranjo do citoesqueleto. A modulação desta maquinaria molecular pela bactéria poderá ser uma estratégia para lidar e escapar à resposta imunitária e para utilizar proteínas do vector necessárias à virulência. Através destes resultados esperou identificar-se potenciais antigénios de carraça que contribuam para o desenvolvimento de uma vacina anti-R. sanguineus e/ou bloqueadora da transmissão de agentes patogénicos.
- Deteção de enteroparasitas e caracterização genética de Cryptosporidium spp. e Giardia duodenalis em crianças até aos 14 anos, com diarreia, em MoçambiquePublication . NHAMBIRRE, Ofélia Luís; DEUS, Nilsa Olívia Razão de; MATOS, Olga Maria Guerreiro de; COSTA, Maria Luísa Lobo Ferreira daAs infeções parasitárias causadas por helmintas intestinais, estão entre as mais prevalentes infeções lentas em humanos no mundo, principalmente nos países em desenvolvimento, incluindo Moçambique e, com as infeções causadas por protozoários intestinais, contribuem significativamente para grande carga de doenças gastrointestinais nestes países, sobretudo nas crianças. Giardia duodenalis e Cryptosporidium spp. são dois organismos protozoários que infetam os humanos e diversas espécies animais e são conhecidos por apresentar um elevado potencial em causar diarreia. Existem em Moçambique alguns estudos sobre a epidemiologia das infeções provocadas por parasitas intestinais, contudo, esta informação é muito fragmentada e escassa sobretudo no que diz respeito à epidemiologia molecular de G. duodenalis e Cryptosporidium spp. Este estudo teve como objetivo geral, determinar a frequência e os fatores relacionados com a infeção por parasitas intestinais (IPI) e caracterizar geneticamente G. duodenalis e Cryptosporidium spp. circulantes em crianças até aos 14 anos de idade com doença diarreica, nas regiões sul, centro e norte de Moçambique. Para o estudo foram analisadas 1424 amostras de fezes diarreicas (do projeto ViNaDia, Moçambique) recrutadas em crianças até 14 anos em seis hospitais públicos das regiões sul, centro e norte de Moçambique. Uma única amostra de fezes foi colhida por criança e examinada por Microscopia Óptica (M.O.) usando a concentração de formol-éter e a técnica de coloração de Ziehl-Neelsen modificada para identificar parasitas intestinais, nomeadamente coccídeos e Cryptosporidium. As características sociodemográficas foram obtidas por meio de questionários. Para caracterização molecular foram utilisadas amostras positivas por M.O. assim como por imunoensaio enzimático (ELISA) (de outro subestudo do projeto ViNaDia). A caracterização genética foi realizada por nested-PCR com alvos nos genes β-giardina de G. duodenlais e ssu rRNA e gp60 de Cryptosporidium spp. Análises uni e bivariadas e regressão logística binária foram realizadas para descrever a população e determinar os fatores de risco. Níveis de significância de 5% foram considerados significativos. Pelo menos uma IPI foi detetada em 19,2% (273/1424) das crianças. Cryptosporidium spp. foi o parasita mais comum (8,1%; 115/1424). Poliparasitismo foi observado em 26,0% (71/273) das crianças estudadas, sendo a coinfeção Ascaris lumbricoides e Trichuris trichiura (26,8%; 19/71) a mais comum. A idade e província foram relacionadas com a presença de IPI (p-valor < 0,05). A maior ocorrência de IPI foi observada na estação das chuvas (outubro a março) com 23,1% (191/828) em relação aos períodos secos (abril a setembro) com 13,6% (80/588) (p-valor < 0,001 ). O subtipo IaA9G3 de C. hominis foi o dominante nas crianças infetadas por Cryptosporidium e o subgenótipo AII de G. duodenalis foi o mais observado (56,6%; 13/23) na população pediátrica moçambicana. Cryptosporidium spp. e a combinação A. lumbricoides/T. trichiura foram os principais parasitas intestinais observados em crianças hospitalizadas com diarreia em Moçambique. Os dados de genotipagem sugerem que as principais vias de transmissão de G. duodenalis e Cryptosporidium em Moçambique são antroponóticas.
- Reservoirs of zoonotic leishmaniosis: the role played by domestic catsPublication . PEREIRA, André Duarte Belchior; MAIA, Carla; PARREIRA, Ricardo; CAMPINO, LeneaA leishmaniose zoonótica causada por Leishmania infantum é um problema grave de saúde pública e veterinária. Contrariamente aos cães, universalmente considerados como principais hospedeiros reservatórios de L. infantum, os gatos domésticos (Felis catus) foram apontados durante anos como hospedeiros acidentais, cuja relevância para a manutenção e transmissão do parasita seria nula. No entanto, o acumular de evidências contrárias mudou o paradigma ao ponto de estes felídeos serem, atualmente, considerados como possíveis hospedeiros reservatórios de L. infantum. Neste contexto, este projeto doutoral teve como objetivo clarificar o papel dos gatos na epidemiologia da leishmaniose zoonótica através da (i) avaliação da exposição dos gatos aos vetores de L. infantum; (ii) determinação da proporção de gatos infetados em focos endémicos; (iii) caracterização da infeção por Leishmania em gatos através de acompanhamento clínico e parasitológico; (iv) realização de tipagem molecular dos parasitas isolados de gatos; e (v) avaliação do comportamento in vitro e infecciosidade ex vivo de estirpes felinas. Anticorpos contra a saliva de Phlebotomus perniciosus foram identificados em 47,7 % (167/350) dos gatos testados, sendo significativamente mais frequente em animais mais velhos e em amostras obtidas durante a época de transmissão (maio a outubro). A presença de anticorpos contra a saliva de P. perniciosus foi associada à infeção por Leishmania em gatos. O ácido desoxirribonucleico (DNA) de Leishmania e/ou anticorpos contra o parasita foram identificados em 7,4 % dos gatos que vivem em focos endémicos. Não foram identificados quaisquer fatores de risco associados à infeção felina. Diagnosticou-se leishmaniose clínica num gato com infeção retroviral (vírus da leucemia felina) concomitante, apresentando sinais clínicos incomuns. A infeção seguiu um padrão crónico e insidioso, sendo refratária à monoterapia com alopurinol. A remissão dos sinais clínicos apenas foi conseguida após tratamento combinado com antimoniato de meglumina. A análise de sequências parciais de citocromo b, glucose-6-fosfato desidrogenase, proteína de choque térmico 70 e espaços intergénicos do DNA ribossomal, revelou que as estirpes isoladas de gatos são geneticamente idênticas a estirpes de L. infantum isoladas de cães, humanos e vetores. Além disso, o DNA de L. major e de parasitas híbridos L. major/L. donovani sensu lato foi detetado em dois gatos de diferentes regiões de Portugal Continental. As estirpes felinas apresentaram um perfil de crescimento in vitro, reposta adaptativa a condições de stress e suscetibilidade a compostos leishmanicidas e leishmaniostáticos, semelhante à de estirpes de L. infantum isoladas de cães e humanos. Os macrófagos de origem felina foram permissivos à infeção ex vivo com parasitas isolados de gatos, cães e humanos, que por sua vez apresentaram semelhante capacidade de infeção de macrófagos felinos, caninos e humanos. Em adição, um algoritmo de diagnóstico para suporte de decisão clínica e um conjunto de orientações para evitar a infeção por Leishmania em gatos, são propostos. Pela interceção dos dados epidemiológicos, moleculares, clínicos e experimentais obtidos no decorrer do presente projeto doutoral, pode-se concluir que Felis catus cumpre todos os critérios estabelecidos pela Organização Mundial de Saúde para ser reconhecida como uma espécie hospedeira reservatória de L. infantum.
- Red blood cell enzymopathies – effects on malaria in-fection: the importance of host cell membrane in host-parasite interactions revealed by atomic force micros-copy and quantitative proteomicsPublication . VAZ, Tiago António Casaca de Rocha; AREZ, Ana Paula; RODRIGUES, JoãoA malária é das doenças infecciosas mais letais do mundo, provocando milhões de casos clínicos e centenas de milhares de mortes todos os anos, principalmente na África subsaariana em crianças com menos de cinco anos. Homem e Plasmodium falciparum têm interagido durante milhares de anos, moldando o genoma um do outro. Esta interac-ção fez com que a malária fosse das mais importantes forças selectivas a actuar no genoma humano. Diversas variantes genéticas do eritrócito têm sido mantidas no genoma humano devido à protecção que conferem contra infecção, ou pelo menos contra doença grave. A deficiência em glucose-6-fosfato desidrogenase (G6PD) e em piruvato cinase (PK) são duas dessas variantes, ambas relacionadas com o metabolismo da célula hospedeira. Apesar de vários estudos terem analisado a protecção contra malária conferida por estas variantes, ainda não se conhece totalmente o mecanismo de protecção e a dinâmica da interacção célula hospedeira-parasita durante a infecção. Como tal, este estudo teve como objectivo compreender melhor: 1) como é que o desenvolvimento do parasita é afectado por estas deficiências; 2) como é que célula hospedeira e parasita interagem du-rante a infecção de eritrócitos com estas deficiências; e 3) qual o mecanismo envolvido na protecção conferida contra doença grave. Através de microscopia de força atómica (AFM) e de proteómica quantitativa baseada em espectrometria de massa, compararam-se eritrócitos não infectados e infectados, e analisaram-se extractos de proteínas, tanto da célula hospedeira, como do parasita. Foi possível simular as deficiências em G6PD e em PK na célula hospedeira através de su-plementação com cloreto de cálcio (no caso da deficiência em G6PD) ou com fluoreto de sódio (no caso da deficiência em PK). A deficiência em PK também foi simulada através da adição directa de bifosfoglicerato, um produto intermédio de metabolismo. As mem-branas de eritrócitos com deficiência (replicada) em PK, tanto infectados como não in-fectados, foram analisadas com AFM. As metodologias de proteómica quantitativa per-mitiram analisar extractos de proteínas de eritrócitos controlo ou com deficiência em G6PD, infectados e não infectados. No seguimento de estudos anteriores (apesar das diferenças não serem significativas), observou-se que a invasão foi inferior em culturas de parasita em eritrócitos com defici-ência em G6PD. A análise feita com AFM revelou diferenças significativas entre membranas de eritrócitos controlo ou com deficiência (replicada) em PK, enquanto a aná-lise quantitativa dos proteomas de parasita e célula hospedeira demonstrou expressão di-ferencial de proteínas associadas ao citoesqueleto do eritrócito, nomeadamente a beta-espectrina. A análise de interacções proteína-proteína revelou grupos de proteínas associ-ados a actividade do proteassoma, resposta ao stress, glicólise e membrana/citoesqueleto da célula hospedeira. Estes resultados apontam claramente para a membrana do eritrócito como sendo fun-damental na interacção parasita-hospedeiro. Os resultados sugerem ainda que alterações na membrana do eritrócito devido a deficiências em G6PD e em PK são responsáveis por uma menor invasão parasitária e, consequentemente, por menores densidades parasitárias. Estes resultados permitem pensar na possibilidade de terapias direccionadas ao hospe-deiro que podem ser desenvolvidas para melhorar a protecção contra malária, mesmo para pessoas sem qualquer tipo de mecanismo inato de protecção.
- Genetic characterization of rotavirus strains in Mozambique, 2012-2018: identification of rotavirus genotypes and full genome sequencing by next generation sequencingPublication . JOÃO, Eva Dora da Cruz; DEUS, Nilsa; MAURÍCIO, Isabel; O'Neill, HesterOs rotavirus do grupo A são uma das principais causas de diarreia aguda grave em crianças menores de 5 anos de idade em todo o mundo. Os vírus também causam infecção em animais jovens de variadas espécies de mamíferos e aves. Existem vários genótipos de rotavirus que causam infecção em crianças, por isso, as pesquisas sobre a circulação e prevalência de estirpes de genótipos de rotavirus circulantes e o sequenciamento do genoma completo são importantes para caracterizacção genética do vírus no país, auxiliando assim na avaliação do impacto da vacina contra rotavirus introduzida no programa alargado de vacinação em Setembro de 2015. Neste contexto, o principal objetivo deste projeto foi caracterizar geneticamente as estirpes de rotavirus circulantes entre 2012 e 2018 em Moçambique, incluindo uma comparação antes e após a introdução da vacina contra rotavirus no país. As estirpes de rotavirus foram detectadas em crianças menores de cinco anos de idade que apresentaram diarreia aguda grave. A caracterização genética de rotavirus foi realizada utilizando RT-PCR, sequenciação de moléculas de DNA pelo método de paragem da polimerização por incorporação de didesoxirribonucleótidos (método de Sanger) e sequenciação do genoma completo da segunda geração (Next Generation Sequencing). Os resultados de RT-PCR mostraram a alta diversidade de genótipos circulantes com variações anuais no período pré e após a introdução da vacina, conforme reportado anteriormente por vários estudos a nível mundial. Antes da introdução da vacina (2012-2013), os genótipos de rotavirus mais frequentes foram G2P[4] e G12P[6] e durante 2014-2015 foram G1P[8] e G9P[8]. Após a introdução da vacina (2016-2018), observou-se o surgimento dos genótipos emergentes como G9P[4], G3P[4] e G3P[8] que não tinham sido detectados antes. O surgimento de novos genótipos de rotavirus no período pós-vacinal reforça a necessidade de uma vigilância contínua em todo o país para monitorizar se o aparecimento de outros genótipos foi devido a vacina. A análise do genoma completo das estirpes dos genótipos G1P[8] e G9P[8] de 2014 e 2016 revelou a circulação de estirpes com um backbone Wa-like típico. Com as análises do genoma completo, foi possível fornecer evidências da diversidade genética do genótipo P[8] em Moçambique ao longo dos anos e foram observadas várias substituições nas regiões antigénicas de rotavirus, sendo importante continuar a vigilância das genótipos para monitorizar o efeito dessas mutações. A análise do genoma completo das estirpes dos genótipos G2P[6] circulantes em 2015 e 2016 revelou um backbone DS1-like típico com alta identidade com estirpes moçambicanas que circularam em 2012 e 2013, entretanto, foram detectados possíveis eventos de reassortments. No presente estudo, apesar da análise do genoma completo de rotavirus ter sido efectuada em estirpes provenientes de diferentes locais de Moçambique, os resultados ilustraram que no país estão em circulação estirpes com o mesmo genetic makeup. Esta tese caracterizou estirpes de rotavirus do grupo A em crianças menores de 5 anos de idade e mostrou a existência de alta diversidade de estirpes circulantes no país. A análise do genoma completo evidenciou que estirpes G1P[8] e G9P[8] têm um backone Wa-like típico e estirpes G2P[6] têm um backbone DS1-like típico. No entanto, é importante a vigilância contínua, como forma de monitorizar os possíveis eventos de reassortment que derivam da pressão da vacina.
- Avaliação com foco na equidade da rede integrada de serviços de saúde do Diabetes Mellitus tipo II em dois municípios do Estado de PernambucoPublication . SILVA, Greciane Soares da; HARTZ, Zulmira; SAMICO, Isabella ChagasA crescente demanda de pessoas com doenças crônicas não transmissíveis, dentre elas a diabetes mellitus tipo 2, requer do modelo de saúde vigente a superação da fragmentação da atenção para atender às necessidades dos usuários e contribuir na prevenção das complicações geradas por essas doenças quando não controladas. As Redes Integradas de Serviços de Saúde são estratégias criadas para superar essa fragmentação oferecendo atenção de forma integral aos usuários. A integração da atenção está intimamente relacionada à Coordenação da Atenção, caracterizada por uma relação harmoniosa dos diferentes serviços necessários para assistência a um usuário ao longo do contínuo de cuidados. O cuidado que não está suficientemente coordenado entre os provedores é uma das principais causas da má qualidade podendo contribuir para eventos indesejáveis como nefropatia diabética. Visando identificar implicações para ocorrência da nefropatia diabética, este estudo avaliou a Rede Integrada de Serviços de Saúde do diabetes mellitus tipo 2 conforme implantação da Coordenação da Atenção, acesso aos serviços de saúde e continuidade assistencial em dois municípios do estado de Pernambuco, Brasil. Realizou-se pesquisa avaliativa, do tipo análise de implantação tendo a nefropatia diabética como evento sentinela. Componentes e critérios para avaliação e determinação do grau de implantação da coordenação da atenção foram derivados do modelo teórico-lógico. As trajetórias assistenciais foram reconstituídas a partir das entrevistas com usuários em terapia renal substitutiva que residiam em área de cobertura assistencial da Atenção Primária à Saúde. Como resultados o estudo revelou que a Coordenação da Atenção não está totalmente implantada nos dois municípios estudados, contudo os casos analisados apontaram a presença de mecanismos de integração entre níveis assistenciais, o que pode indicar um comprometimento com a garantia da continuidade assistencial. Verificaram-se também barreiras relacionadas à ausência dos protocolos para estratificação de riscos e vulnerabilidades; ausência do prontuário eletrônico, bem como a ausência de troca de informações entre os profissionais dos níveis assistenciais. A acessibilidade entre os níveis assistenciais se mostrou favorável à Atenção Especializada em detrimento a Atenção Primária à Saúde. Um fator de destaque para tal fato pode ser atribuído ao longo tempo de espera para atendimento, para a realização de exames e/ou recebimento do diagnóstico pela Atenção Primária à Saúde. A trajetória assistencial dos usuários com nefropatia diabética revelou falhas na continuidade assistencial, tais como ausência de comunicação entre os profissionais da Atenção Primária à Saúde e a Atenção Especializada; ausência de vínculo entre os usuários e profissionais; longo tempo de espera para atendimento e/ou realização de exames complementares no primeiro nível de atenção. Conclui-se que a integração dos serviços de saúde envolvidos na atenção de portadores de diabetes mellitus tipo 2, ainda não está adequada para sanar a fragmentação da atenção e garantir a qualidade da assistência.