IHMT: MM - Teses de Doutoramento
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- Antimalarial resistance in Mozambique: characterization of molecular markers and assessment of Plasmodium falciparum susceptibility to artemisinin based combination therapyPublication . SILVA, Clemente da; NOGUEIRA, Fátima; ENOSSE, SóniaIntrodução: A malária continua a ser um dos mais graves problemas de saúde pública na África Subsaariana e Moçambique é o quarto maior contribuinte mundial, com 4,7% dos casos da doença e 3,6% do total de mortes devido à malária. O seu controlo assenta no combate ao vetor e no tratamento dos casos confirmados com medicamentos antimaláricos. A vigilância molecular da malária é um instrumento importante para monitorizar a propagação da resistência aos medicamentos antimaláricos. O principal objetivo deste estudo foi estudar a resistência aos ACTs através da caraterização de marcadores moleculares e da avaliação da suscetibilidade ex vivo do Plasmodium falciparum aos medicamentos antimaláricos administrados em Moçambique. Métodos: Este projecto de tese consistiu em estudos transversais ao longo do pais incluindo ensaios de susceptibilidade do P. falciparum aos farmacos e a genotipagem. Os ensaios de suscetibilidade foram realizados em 43 amostras positivas para malária não complicada na província de Maputo entre maio e julho de 2022. Adicionalmente, o perfil dos polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) pfk13 e pfmdr1, bem como a variação do número de cópias (CNV) pfpm2 e pfmdr1 de isolados fenotipicamente suscetíveis aos antimaláricos foi avaliado por sequenciação de Sanger e reação em cadeia da polimarase quantitativa em tempo real (qPCR), respetivamente. Paralelamente, com o objetivo de caraterizar marcadores moleculares de resistência aos antimaláricos, foi realizado um estudo transversal que recrutou ~600 participantes com infeção por malária detectada por Testes de Diagnóstico Rápido (TDR), de três locais de estudo diferentes (Niassa, Manica e Maputo) entre abril e agosto de 2021. O software SIFT (Sorting Intolerant from Tolerant) foi utilizado para prever se uma substituição de aminoácidos afecta a função da proteína Kelch 13. Resultados: Quanto aos ensaios de susceptibilidade, as taxas de sobrevivência revelaram a ausência de parasitas sobreviventes quando expostos a 700 nM de diidroartemisinina (DHA), 200 nM de piperaquina (PPQ) e amodiaquina (AQ). As taxas foram inferior a 1%, 10% e 45%, que são os limiares para ring stage susceptibility assay (RSA), piperaquine susceptibility assay (PSA) e amodiaquine susceptibility assay (AQSA), respetivamente. Quanto à genotipagem, não foi detectada qualquer mutação validada no gene de resistência à artemisinina, pfk13, nos locais do estudo. No entanto, foram detectadas mutações não sinónimas com uma prevalência de 10,2%, 6% e 5% em Niassa, Manica e Maputo, respetivamente. 56,3% das mutações não-sinónimas registadas deveu-se à substituição na primeira base do codão, 25% na segunda base e 18,8% na terceira base. Além disso, 50% das mutações não-sinónimas apresentaram um SIFTscore inferior ao limiar, 0,05, pelo que se previu que fossem deletérias. Após a ddPCR detectou-se CNVs de pfpm2 e pfmdr1 em 5,7% (13/229) das amostras de alta qualidade. Conclusão: Os parasitas em circulação nos locais estudados continuam a apresentar uma elevada sensibilidade aos antimaláricos, sem mutações associadas à resistência à artemisinina e ao seu parceiro. A monitorização contínua da suscetibilidade do parasita aos ACT e a vigilância molecular devem ser intensificadas para reduzir as hipóteses de resistência à artemisinina num futuro próximo.
- Caracterização do micobioma em unidades de cuidados intensivosPublication . NASCIMENTO, Teresa Maria Silva do; BARROSO, Maria Helena Sousa; INÁCIO, João; VIVEIROS, MiguelO micobioma é um componente importante do microbioma humano. Apesar da sua relevância tem sido pouco estudado, especialmente em doentes internados em unidades de cuidados intensivos (UCI). Neste contexto, este estudo prospetivo multicêntrico, realizado entre 2020 e 2022 em doentes em UCI na área metropolitana de Lisboa teve como objetivo avaliar a importância do ambiente nosocomial na colonização fúngica da pele, com especial enfoque no género Candida e particularmente C. auris. Mais especificamente, avaliar a dinâmica da colonização fúngica e os factores de risco associados tanto na admissão (D1) quanto ao longo do internamento, ao 5º (D5) e 8º dia (D8). A análise incluiu a caracterização do micobioma, os perfis de susceptibilidade aos principais antifúngicos utilizados na prática clínica e o impacto nos índices de sobrevivência. De 675 doentes foram obtidos 988 exsudados combinados bilaterais das regiões intertriginosas axilar e inguinal, especificamente: 675, 203 e 110 amostras em D1, D5 e D8 respetivamente. A micobiota (n=371) foi identificada por métodos fenotípicos, MALDI-TOF MS e PCR, e verificou-se que o género Candida foi dominante (n=355). C. albicans foi a espécie mais prevalente (52,1%) seguida por C. parapsilosis (30,7%). Porém, identificou-se um desvio nesta coorte, de C. albicans para espécies de Candida não-albicans, dependente da unidade hospitalar (p= 0,011). Os resultados evidenciaram a ausência de C. auris apesar da sua pesquisa por PCR em tempo real e métodos convencionais, aos quais se adicionou um meio de cultura seletivo, desenvolvido neste estudo, o Manitol Salt Agar Auris. A colonização fúngica observada foi de 184/675 (27,3%), 87/203 (42,8%) e 58/110 (52,7%) no D1, D5 e D8, respetivamente. A dinâmica da colonização por Candida spp. foi significativamente associada ao tipo de UCI (Odds Ratio (OR)= 2,03, IC 95% 1,22- 3,39, p= 0,007), infeção respiratória (OR= 1,74, IC 95% 1. 17-2,58, p= 0,006), hemodiálise (OR = 2,19, IC 95% 1,17-4,10, p= 0,014), COVID-19 (OR = 0,37, IC 95% 0,14-0,99, p= 0,048) e a uma menor taxa de sobrevivência a 3 meses (p= 0,008). O grau de colonização por Candida spp. foi elevado (superior a 100 UFC/mL) em 77,2% dos doentes. O micobioma das amostras dos doentes em UCI (D1 e D8) obtido por metasequenciação evidenciou diversidade genética, com predomínio marcado do género Candida, mas sem associação significativa com o internamento na UCI (p= 0,499). Os perfis de susceptibilidade antifúngica in vitro para o fluconazol, voriconazol, anfotericina B e anidulafungina, foram obtidos através do método epsilométrico (Etest®) e mostraram que a resistência continua a ser pouco comum entre os isolados de Candida spp. nas UCI investigadas, sem alterações significativas ao longo do tempo de internamento ou entre unidades hospitalares. Destaca-se deste estudo, a utilização da colonização da pele por Candida spp. como uma ferramenta de alerta precoce para informar sobre os factores de risco e índices de sobrevivência dos doentes em estado crítico. Perspetiva-se que o conhecimento da dinâmica do micobioma da pele em doentes internados em UCI seja fundamental para compreender as alterações associadas à colonização, bem como a possível infeção dos doentes.
- Carbapenem resistance in veterinary healthcare and in sick companion animalsPublication . SILVA, Joana Cabral Moreira da; POMBA, Maria Constança; AMARAL, AndreiaOs carbapenemos são antibióticos de última linha em medicina humana e o seu uso é proibido em medicina veterinária, para que a sua utilização terapêutica continue a ser possível. Contudo, os níveis de resistência estão a aumentar mundialmente e têm surgido descrições de resistência a esta classe em animais de companhia. Na primeira parte desta tese, foi feita uma avaliação da prevalência de Enterobacterales produtores de carbapenemases em Portugal, provenientes de estirpes clínicas de animais companhia, assim como uma caracterização dos seus elementos genéticos móveis. Dos 977 isolados clínicos de Enterobacterales originários de um laboratório de diagnóstico veterinário, 261 isolados resistentes foram estudados e a sequenciação do genoma completo foi feita para estirpes produtoras de carbapenemases. A frequência observada foi de 0,51% (n=5/977) e incluiu uma Klebsiella pneumoniae ST273 produtora de OXA-181, duas K. pneumoniae ST147 produtoras de KPC-3, uma K. pneumoniae ST392 produtora de KPC-3 e uma Escherichia coli ST127 produtora de OXA-48. O gene blaKPC-3 encontrava-se no transposão Tn4401d em plasmídeos do tipo IncFIA e IncN, enquanto o gene blaOXA-181 encontrava-se num plasmídeo do tipo IncX3. Todos os plasmídeos e transposões eram homólogos aos descritos em medicina humana. Estas descobertas sugerem a ocorrência de uma disseminação horizontal destas bactérias de humanos para animais de companhia, realçando a importância de realizar o rastreio de resistência aos carbapenemos em laboratórios de diagnóstico veterinário e a implementação de medidas de prevenção e controlo de infeção (PCI) para que se evite a disseminação destas bactérias na comunidade. Com o aumento do número de animais de companhia por família, acompanhado pela evolução dos níveis de cuidados prestados em centros de atendimento médico-veterinários (CAMV), é expectável que o número de infeções nosocomiais provocadas por bactérias multirresistentes venha a aumentar, à semelhança do que ocorre em hospitais humanos. Contudo, contrariamente ao que existe em medicina humana, onde protocolos de PCI monitorizam o surgimento de bactérias multirresistentes no ambiente, em medicina veterinária a implementação destes protocolos está aquém do expectável. Assim, a avaliação do nível de contaminação ambiental e colonização das equipas foi realizada em diferentes CAMV em Portugal. Catorze CAMV foram avaliados, com amostragem de superfícies críticas e colheita de amostras nasais, retais e de mãos da equipa. Para todas as amostras, foram rastreadas bactérias Gram-negativas produtoras de beta-lactamases de espetro alargado e/ou carbapenemases. As concentrações mínimas inibitórias de imipenemo e meropenemo foram calculadas para bactérias produtoras de carbapenemases. A sequenciação do genoma completo foi feita para bactérias resistentes aos carbapenemos. A avaliação ambiental demonstrou que 6,5% das superfícies testadas estava contaminada com bactérias Gram-negativas multirresistentes, nomeadamente: i) um CAMV tinha Acinetobacter spp. produtor de OXA-23 (n=5); ii) outro CAMV tinha Pseudomonas juntendi produtora de IMP-8; iii) isolados de Stenotrophomonas maltophilia (n=12) e Pseudomonas aeruginosa (n=3) foram encontrados em várias superfícies de múltiplos CAMV. Estirpes de P. aeruginosa resistentes aos carbapenemos, que apresentavam mutações na porina OprD, foram isoladas de duas amostras retais e uma amostra de mãos. Estirpes de S. maltophilia foram encontradas no total de quatro amostras (duas retais, duas de mãos). Uma amostra nasal testou positivo para K. pneumoniae ST11 resistente aos carbapenemos por truncatura da OmpK36. Estes resultados apontam para o papel que os CAMV poderão ter na disseminação de bactérias multirresistentes. Adicionalmente, torna-se claro que é fundamental implementar protocolos de PCI, auditados com regularidade, em conjunto com workshops educacionais para estudantes e profissionais de medicina veterinária. Em conclusão, bactérias resistentes aos carbapenemos estão presentes em animais de companhia doentes e no ambiente dos CAMVs, evidenciando o papel que estes setores têm na disseminação destas bactérias no contexto da Uma Só Saúde.
- Wolbachia in medically important mosquitoes from Cape Verde: prevalence, genetic diversity and role in vector competencePublication . MOURA, Aires Januário Fernandes da; PINTO, João; SOUSA, CarlaWolbachia pipientis é uma bactéria endossimbiótica atualmente utilizada no controlo de doenças transmitidas por vetores, devido à sua capacidade de induzir incompatibilidade citoplasmática e suprimir a replicação de arbovírus em mosquitos vetores. O objetivo deste estudo foi avaliar a prevalência e a diversidade genética de Wolbachia em diferentes espécies de mosquitos (Diptera: Culicidae) em Cabo Verde, bem como avaliar a influência deste endossimbionte na transmissão do vírus do Nilo Ocidental (WNV) pelo vetor Culex quinquefasciatus. As amostras de mosquitos foram colhidas em seis ilhas de Cabo Verde. A deteção de Wolbachia nos mosquitos foi realizada através da amplificação de um segmento do gene da proteína de superfície (wsp). A identificação da estirpe foi efetuada por Tipagem de Sequência Multilocus (Multilocus Sequence Typing, MLST), utilizando genes constitutivos (gatB, coxA, hcpA, fbpA e ftsZ) e a região hipervariável do wsp (HVR). A classificação dos grupos wPip foi determinada por PCR-RFLP, direcionada para o gene da anquirina (pk1). Para avaliar o impacto da Wolbachia nativa na competência vetorial, fêmeas de Cx. quinquefasciatus, infetadas e não infetadas com Wolbachia, provenientes da ilha de Santiago, foram expostas à estirpe PT6.39 do WNV utilizando um sistema de alimentação por membrana. Posteriormente, a infeção por WNV foi avaliada por One-step RT-qPCR aos 7, 14 e 21 dias pós-infeção (dpi). Wolbachia foi detetada em Culex tigripes (100% de prevalência), Cx. quinquefasciatus (98,3%), Cx. pipiens s.s. (100%) e em híbridos Cx. pipiens/quinquefasciatus (100%). As análises MLST e filogenética revelaram que a Wolbachia do complexo Cx. pipiens pertence à Sequence Type (ST) 9, ao clado wPip e ao Supergrupo B. A Wolbachia isolada de Cx. tigripes também foi classificada no Supergrupo B, mas formou uma linhagem única, distinta do clado wPip, sem perfil MLST atribuído. Os resultados PCR-RFLP indicaram a presença de wPip-II, wPip-III e wPip-IV em Cabo Verde. As avaliações de competência vetora demonstraram que as fêmeas de Cx. quinquefasciatus desprovidas da sua Wolbachia nativa apresentaram títulos de WNV significativamente mais elevadas nos seus corpos e uma disseminação aumentada do vírus, em comparação com os seus homólogos de tipo selvagem com Wolbachia. A elevada diversidade dos grupos wPip observada sugere múltiplas introduções de Cx. pipiens s.l. em Cabo Verde e fornece informações cruciais para o desenvolvimento de futuras estratégias de controlo baseadas em Wolbachia no arquipélago. Relata-se a primeira ocorrência de Wolbachia na espécie Culex tigripes, que provavelmente representa uma nova estirpe do endossimbionte, com implicações promissoras para as estratégias de controlo vetorial. A Wolbachia nativa de Cx. quinquefasciatus aparenta restringir a disseminação do vírus do Nilo Ocidental (WNV), sendo necessários estudos adicionais para elucidar o mecanismo subjacente a esta proteção mediada por Wolbachia.
- Identificação de modificadores genéticos em crianças com anemia de células falciformes numa área endémica de Malária, AngolaPublication . SANTOS, Brígida Marisa de Almeida Ferreira dos; BRITO, Miguel; AREZ, Ana Paula; FAUSTINO, PaulaResumo Introdução: A Anemia de Células Falciformes (ACF) é uma doença genética de transmissão autossómica recessiva que resulta de uma mutação na posição 6 da cadeia de β-globina com substituição de um ácido glutâmico por valina. É a doença monogénica mais frequente a nível mundial com elevada prevalência em África, caracterizada por fenómenos vaso-oclusivos e hemólise crónica. As manifestações clínicas são muito heterogéneas, de gravidade variável entre os pacientes devido a factores ambientais e a existência de importantes modificadores genéticos. Uma das intervenções terapêuticas é o uso da Hidroxiureia (HU) que tem como acção principal a indução da hemoglobina fetal, embora com resposta variada entre os pacientes. Objetivo: O objectivo deste trabalho consistiu na identificação de modificadores genéticos e no estudo da resposta à terapêutica com HU em crianças com ACF residentes em Angola, onde a malária é endémica. Metodologia: O estudo incluiu 215 crianças dos 3 aos 12 anos de idade tendo sido feita a sua caracterização genética pela a análise de regiões polimórficas em genes associados à variação da HbF, à adesão celular (VCAM1 e CD36), tónus vascular (NOS3) e hemoglobinização dos eritrócitos (HBA). Também foi feita, durante a medicação com HU, a análise longitudinal dos fenótipos clínicos, hematológicos e bioquímicos e suas possíveis interações com a infecção malárica. Resultados: Os resultados demonstraram uma significativa heterogeneidade fenotípica entre os pacientes quanto ao início das manifestações clínicas, número de transfusões e de internamentos. A análise longitudinal para além de avaliar a influência da infecção malárica na evolução clínica da ACF permitiu identificar, pela análise comparativa nas duas fases do estudo (pré e pós-HU), os benefícios da medicação. Os estudos de associação entre as variantes identificadas e os fenótipos permitiram estabelecer que a evolução clínica mais suave foi associada à co-herança da deleção -3,7kb da α-talassémia, à presença do polimorfismo rs1041163 T>C no gene VCAM1 associado à menor taxa de hemólise, variantes rs4671393_A, rs11886868_C, rs1427407_T e rs7557939_G, no gene BCL11A, variantes rs7483144_A no gene HBG2 e rs66650371_T no gene HBS1L-MYB associados a níveis mais altos de de HbF. A maior gravidade da doença foi associada a níveis mais baixos de HbF encontrados no haplótipo CAR/CAR, variantes rs2070744_C, no gene NOS3 e rs1041163 T>C no gene VCAM1 associadas a maior taxa de hemólise e, as variantes rs1984112_G e rs1413661_C no gene CD36 estiveram associados à gravidade da anemia. Conclusão: Este estudo permitiu conhecer a heterogeneidade clínica e laboratorial da ACF em crianças angolanas, confirmar os benefícios da HU permitindo assim a aquisição de bases para a implementação de directrizes do uso da HU num contexto de alta prevalência da doença e recursos financeiros limitados. Os estudos de associação genótipo-fenótipo contribuíram para o melhor conhecimento da complexidade que é a ACF.
- Gut microbiome analysis in patients with Sickle Cell DiseasePublication . DELGADINHO, Mariana Isabel Neves; BRITO, Rui Miguel Duque; AREZ, Ana Paula; VEIGA, Luísa Maria Carvalho deRESUMO A anemia falciforme (AF) é uma das doenças monogénicas hereditárias mais comuns mundialmente, afetando mais de 300,000 recém-nascidos todos os anos e contribuindo até 90% da mortalidade em crianças com menos de 5 anos na África Subsariana. As manifestações clínicas são altamente heterogéneas e o microbioma intestinal parece ser essencial numa variedade de processos, como a modulação da inflamação, adesão celular e indução de neutrófilos maduros, um dos principais intervenientes das crises vaso-oclusivas recorrentes. Tendo estes aspetos em consideração, o objetivo principal deste trabalho foi demonstrar a influência do microbioma intestinal na AF. Para tal, os nossos objetivos específicos foram: caracterizar o microbioma intestinal de pacientes com AF quando comparado com um grupo controlo; investigar a influência do fármaco mais utilizado nesta doença, a hidroxiureia, no microbioma desta população; verificar o impacto das moléculas de adesão na composição microbiana; estudar a relação entre a presença de parasitas intestinais e microbioma, e o seu efeito na sintomatologia. Um total de 113 amostras fecais foram colhidas de 40 crianças angolanas com AF antes do tratamento com hidroxiureia (HU), 33 depois e 40 de um grupo controlo de irmãos saudáveis. Várias metodologias foram adotadas neste estudo, tais como: sequenciação 16S rRNA para análise do microbioma, medição de moléculas de adesão solúveis no sistema Luminex MAGPIX e qPCR em tempo real para a deteção de oito parasitas intestinais. Algumas diferenças microbianas notáveis foram reportadas neste estudo, tais como uma menor abundância de Blautia e uma maior prevalência de Clostridium XI nas crianças com AF comparativamente com as do grupo controlo. Após os seis meses de tratamento com HU, as crianças com AF possuíam uma proporção mais alta de diversas bactérias produtoras de ácidos gordos, essenciais na modulação da inflamação. Adicionalmente, diversas bactérias do género Clostridium estavam positivamente correlacionadas com os níveis de leucócitos, neutrófilos, algumas moléculas de adesão e negativamente correlacionadas com os níveis de hemoglobina fetal. Finalmente, demonstrámos que a presença de certos parasitas diminui a prevalência de uma variedade de bactérias benéficas como: Lactobacillus, Bifidobacterium, Cuneatibacter, Bacteroides uniformis, Roseburia and Shuttleworthia. O presente trabalho analisou pela primeira vez o microbioma de uma população angolana com AF, mas ainda há muito a aprender antes de confiarmos plenamente nas abordagens terapêuticas de modulação intestinal, sendo por isso essencial efetuar mais investigação nesta área antes de tornar esta abordagem uma realidade para utilização generalizada.
- Molecular and clinical epidemiology of rotavirus group A, in children less than 5 years of age, pre and post vaccine introduction, in a matched case-control study in Manhiça district, Mozambique, 2008- 2021Publication . MANJATE, Filomena Arlindo; CUNHA, Celso Vladimiro Ferreira de Abreu; NYAGA, Martin Munene; JOÃO, Eva Dora da CruzResumo Rotavírus é o principal agente etiológico da diarreia em crianças <5 anos, com maior peso de mortes na Ásia e África Subsaariana, incluindo Moçambique, onde ainda existem poucos dados sobre a sua epidemiologia, antes e depois da introdução da vacina. O presente projeto visava avaliar o impacto da vacina contra o rotavírus em crianças <5 anos; Descrever os genótipos circulantes entre crianças com diarreia moderada-a-severa e leve (siglas em inglês MSD e LSD) e sem diarreia (controlos comunitários saudáveis) e realizar a sequenciação do genoma completo de genótipos comuns nestes grupos, para avaliar as suas diferenças ou semelhanças, antes e depois da introdução da vacina no Distrito da Manhiça, Moçambique. Foram analisados casos de diarreia dectados passivamente através do sistema de vigilância de morbidade, e análise laboratorial para a deteção de rotavirus usando o ensaio de imunoabsorção enzimática. Os genótipos foram determinados através de transcrição reversa-reacção em cadeia de polimerase e a sequenciação do genoma completo através da sequenciação de nova geração, usando a plataforma Illumina® MiSeq. A prevalência de rotavirus reduziu de 22.9% antes para 11.5% depois da introdução da vacina. O genótipo G12P[8] foi mais frequente em casos MSD e controlos e G12P[6] em casos LSD antes da introdução da vacina. Depois da introdução da vacina, G3P[4] e G3P[8] foram mais frequentes em casos MSD e LSD. Foi feita a sequenciação das estirpes G3P[8], G2P[4], G2P[6], G3P[4], G8P[4], G8P[6] e G9P[6] de casos MSD, LSD e controlos. Verificou-se que, G3P[8] apresentava a constelação designada Wa-like (G3P[8]-I1-R1-C1-M1-A1-N1-T1-E1-H1) e as outras combinações a constelação DS-1-like (G2/G3/G8-P[4]-I2-R2-C2-M2-A2-N2-T2-E2-H2); (G2/G8/G9-P[6]-I2-R2-C2-M2-A2-N2-T2-E2-H2). As análises filogenéticas mostraram similaridades entre as estirpes estudadas e estas com estirpes que circulam em Moçambique e mundialmente. Os segmentos 9, 6, 1, 7 e 10 que codificam a VP7, VP6, VP1, NSP3 e NSP4 respectivamente, das estirpes Wa-like, agruparam-se com estirpes suínas, equinas e bovinas, com similaridades entre 86.9–99.9% de nucleótidos e 97.2–100% de aminoácidos. O segmento 4 que codifica a VP4 (P[4]) e o segmento 9 que codifica a VP7 (G9, G3), o segmento 10 que codifica a NSP4 nas estirpes G3P[4] e G8P[4] agruparam-se com estirpes porcinas, bovinas e caprinas. O segmento 1 que codifica a VP1 nas estirpes G2P[6] agrupou-se com uma estirpe de camelo, com identidades médias de 89,1%-99,0% de nucleótidos e 89,5%-99,0% de aminoácidos. A vacina contribuiu para a diminuição de casos de RVA em crianças <5 anos. No entanto, ainda é necessária uma vigilância ativa para avaliar o peso em outras faixas etárias, não elegíveis para a vacinação. Foram observados genótipos semelhantes entre casos e controlos, embora com uma mudança na prevalência e genótipos que circularam antes e depois da introdução da vacina, que pode ser resultado da capacidade de evolução do virus. As estirpes com similaridade com estirpes animais, podem ser resultado de rearranjos genéticos, daí a necessidade de monitorar os genótipos por técnicas avançadas para compreender as alterações evolutivas. Estes resultados reforçam a necessidade de avaliar o impacto dessas estirpes na efectividade da vacina atualmente em uso em Moçambique.
- Epidemiological, phenotypic and molecular profile of Staphylococcus aureus causing bacteraemia in children younger than 5 years in Manhiça district, Mozambique, 2001 2019Publication . GARRINE, Marcelino de Oliveira Graciano; COUTO, Isabel; MANDOMANO, Inácio; COSTA, Sofia SantosResumo A bacteremia estafilocócica, em particular a associada a Staphylococcus aureus (SAB), é uma das infeções da corrente sanguínea mais comuns em todo o mundo, mas ainda pouco caracterizada em Moçambique, particularmente ao nível da caracterização epidemiológica e das estirpes bacterianas associadas, informação essencial para definir estratégias de controlo e prevenção eficazes. Neste Doutoramento procurou-se descrever a epidemiologia de SAB e caracterizar S. aureus isolados em hemoculturas de crianças menores de 5 anos internadas no Hospital Distrital de Manhiça, Moçambique, ao longo de duas décadas (2001-2019). A incidência de SAB foi calculada a partir do sistema de vigilância demográfica do distrito da Manhiça. Entre 2001 e 2019, 8% (3.197/41.891) destas crianças apresentaram bacteremia, 12% das quais correspondendo a SAB. A incidência global de SAB foi de 56,1 episódios/100.000 crianças-anos em risco (CYAR), sendo mais elevada entre os neonatos (589,8 episódios/100.000 CYAR). A incidência de SAB diminuiu significativamente, de 322,1 para 12,5 episódios/100.000 CYAR entre 2001 e 2019. A análise de suscetibilidade aos antimicrobianos revelou uma elevada frequência de estirpes multirresistentes - MDR (25%, 85/336), mas reduzido número de S. aureus resistentes à meticilina - MRSA (5% 16/336). Detetou-se elevada frequência de resistência à penicilina (90%, 304/336), um antibiótico prescrito empiricamente (em combinação com a gentamicina) para doentes com suspeita de doença bacteriana invasiva. A mortalidade hospitalar por SAB foi de 9% (31/332), sendo significativamente associada a infeções por estirpes MDR (p = 0,043) e MRSA (p = 0,006). A tipificação molecular por SmaI-PFGE, spa typing e MLST revelou elevada diversidade de clones de S. aureus circulantes, com predominância dos complexos clonais CC5 (17%, 58/336) e CC8 (16%), seguidos por CC15 e CC1 (11% cada). A linhagem CC152, inicialmente detetada em 2001, ressurgiu em 2010 e tornou-se predominante no restante período de vigilância, enquanto outros CCs (CC1, CC5, CC8, CC15, CC25, CC80 e CC88) diminuíram ao longo do tempo. As 16 estirpes MRSA detetadas pertencem aos clones t064-ST612/CC8-SCCmecIVd (11/16), t008-ST8/CC8-SCCmecNT (4/16) e t5351-ST88/CC88-SCCmecIVa (1/16). Os genes lukSF-PV, que codificam para a leucocidina de Panton-Valentine foram detetados em 44% (147/336) das estirpes, predominando nos CC22 (100%), CC152 (97%) e CC121 (85%). Nenhuma das estirpes MRSA apresentou estes genes. A produção de biofilme foi frequentemente detetada para estirpes das linhagens emergentes CC152 e CC121 (80%, 52/65), sendo esta produção particularmente forte nas estirpes CC152. Os ensaios de infeção de Galleria mellonella com estirpes representativas evidenciaram um elevado potencial de virulência das estirpes clínicas testadas, com variações dentro e entre os CCs analisados. Apesar da incidência decrescente de SAB na nossa população, a mortalidade associada é ainda elevada, possivelmente relacionada com a infeção por estirpes MDR ou MRSA não tratáveis com os antibióticos comummente disponíveis. Estes resultados indicam uma necessidade urgente da revisão da pauta antibiótica empírica actual em Moçambique, tal como suportado pela actual preocupação relativa a resistência antimicrobiana. Adicionalmente, deve ser priorizado o desenho e implementação de medidas preventivas direcionadas para clones associados a SAB emergentes, incluindo o desenho de abordagens para a deteção precoce e tratamento de crianças com infeções potencialmente letais.
- The role of muscle in SpondyloarthritisPublication . SARDOO, Atlas Mashayekhi; SANTOS, Fernando Pimentel dos; CUNHA, CelsoA espondiloartrite axial (axSpA) é uma doença reumática inflamatória, caracterizada principalmente pelo envolvimento da coluna e articulações sacroilíacas, e geralmente apresenta-se como dor crónica nas costas e rigidez. À medida que a doença progride, a mobilidade da coluna vertebral e a função física são prejudicadas podendo afetar as atividades da vida diária. A genética e os fatores ambientais (microbiota e microtrauma) são as causas conhecidas da suscetibilidade e progressão da doença. Esta tese teve como objetivo melhorar o nosso conhecimento atual da fisiopatologia da axSpA, caracterizando as propriedades musculares axiais e periféricas e identificando biomarcadores genéticos e proteicos que possam explicar tais propriedades. Realizamos um estudo transversal com 54 participantes: 27 pacientes com axSpA e 27 controles saudáveis (HC), pareados por idade, sexo e nível de atividade física. Dados epidemiológicos, clínicos e de caracterização muscular (propriedades físicas musculares, força, massa e desempenho) foram registados e comparados entre pacientes com axSpA e HC. Foi ainda colhido sangue periférico para abordagens ómicas. A transcriptómica e a proteómica foram realizadas por sequenciação de RNA e tecnologias de espectrometria de massa, respectivamente. Os nossos resultados indicam que pacientes com axSpA (idade média de 36,5 (DP 7,5) anos, 67% do sexo masculino e duração média da doença de 6,5 (3,2) anos) não apresentaram diferença significativa na rigidez muscular segmentar em comparação com os HC, apesar de apresentarem uma discreta menor rigidez lombar. Pacientes com axSpA, comparados com os HC, apresentaram menor força total, bem como menor força nos membros superiores e inferiores, independentemente das propriedades físicas dos músculos. Os pacientes também apresentaram velocidades de marcha significativamente menores do que o HC. As características da marcha podem representar um potencial biomarcador em pacientes com axSpA. A análise de enriquecimento de genes expressos diferencialmente permitiu revelar vias metabólicas significativas (como sinalização de IL6 e vias do sistema imunológico) com papel patológico para esse grupo de pacientes. Salienta-se ainda que níveis séricos aumentados de várias citocinas pró-inflamatórias em pacientes com axSpA foram observados em correlação adequada com os parâmetros de atividade da doença. Além disso, foram identificados genes expressos diferencialmente associados ao músculo (como NACA, FRG1 e ARPC5L) desempenham papeis no desenvolvimento de miotubos e montagem de actina, afetando eventualmente a força muscular em pacientes com axSpA. Finalmente, a integração dos resultados da transcriptómica e da proteómica mostra que a análise dos genes e proteínas diferencialmente expressos permite obter uma clara discriminação entre pacientes com axSpA e HCs, possibilitando ainda avançar no diagnóstico, prognóstico e eventuais opções terapêuticas para esse grupo de pacientes. Globalmente, os resultados aqui obtidos permitem oferecer algumas possibilidades interessantes para explicar o papel do músculo na patogénese da axSpA.
- Caraterização de vírus específicos de insetos: análise da sua diversidade genética e relação com outros vírusPublication . MORAIS, Paulo Jorge Sampaio; PARREIRA, Ricardo; ABECASIS, AnaOs arbovírus são responsáveis por doenças com impacto significativo na saúde humana, sendo transmitidos a humanos e outros animais por insetos e outros vetores invertebrados. Entre estes últimos, os mosquitos representam um dos mais importantes vetores conhecidos por servirem de vetores a arbovírus patogénicos para os humanos, de que são exemplos os vírus da dengue e Zika. Por muito tempo, a pesquisa de vírus foi impulsionada pelo impacto que estes agentes impõem à saúde humana/animal/plantas, mas os desenvolvimentos nas últimas décadas nos domínios das tecnologias de sequenciação de alto rendimento e bioinformática permitiram melhorias nas estratégias de descoberta de vírus, o que, por sua vez, levou a um aumento no número de vírus peculiares que vieram a ser descobertos em rastreios virológicos, alguns com replicação restrita em células de vertebrados. Acredita-se que esses vírus, designados vírus específicos de insetos, tenham impacto nulo ou baixo na saúde animal e, provavelmente por isso mesmo, tenham permanecido à sombra de arbovírus patogénicos. No entanto, nas últimas décadas eles tornaram-se no foco da nossa atenção, não apenas pela sua extensa diversidade e estratégias incomuns de replicação restrita nalguns hospedeiros, mas também pelo seu potencial de interferir na replicação de arbovírus. Desde então, diversos vírus específicos de insetos foram descobertos em várias famílias de vírus, com vírus específicos de mosquitos associados especialmente às famílias Flaviviridae, Mesoniviridae e Parvoviridae. Neste projeto procurou-se detetar e analisar novas sequências de vírus específicos de insetos dessas três famílias virais em mosquitos coletados em Portugal, Angola e Moçambique. A diversidade genética, reconstrução filogenética e avaliações filodinâmicas foram então executadas, usando tanto sequências genómicas geradas de novo, bem como de sequências disponíveis em bases de dados públicas. Novas sequências de flavivírus específicos de insetos ditos "clássicos" (cISF) foram detetadas em pools de mosquitos das três regiões geográficas, e diferentes sub-linhagens de cISF foram caracterizadas. A sua análise filodinâmica sugeriu que a dispersão de cISF no espaço e no tempo deverá ser recente e bastante dinâmica. Por outro lado, embora dados insuficientes não tenham permitido uma análise filodinâmica completa com base em sequências de mesonivírus, foi realizada uma extensa revisão taxonómica, que incluiu a análise de sequências semelhantes a mesonivírus (meson-like viruses) recentemente detetadas em outros organismos que não mosquitos. Por fim, também procurámos analisar entre os parvovírus de invertebrados aqueles que têm sido incluídos no género Brevihamaparvovirus, cuja distribuição até ao momento parece ser restrita a algumas espécies de mosquitos. Os seus genomas parecem evoluir sob forte seleção negativa e também são caracterizados por baixa entropia, tal como foi igualmente observado para flavivírus e mesonivírus. Também realizámos uma revisão taxonómica do táxon (o primeiro para brevihamaparvovírus) e efetuámos a sua primeira reconstrução filodinâmica.