Utilize este identificador para referenciar este registo: http://hdl.handle.net/10362/20432
Título: Canine leishmaniasis: the role of hepatocytes and Kupffer cells during Leishmania infantum infection
Autor: Rodrigues, Maria Armanda Viana
Orientador: Gomes, Gabriela Santos
Palavras-chave: Leishmaniose canina
Hepatócitos
Células de Kupffer
Imunidade
Memória celular
Data de Defesa: 2017
Resumo: A leishmaniose canina (LCan) é uma doença zoonótica causada por Leishmania infantum, um parasita protozoário transmitido por flébotomos. O fígado constitui um órgão vital e de grande importância metabólica, sendo também um alvo preferencial para L. infantum. Apesar do complexo metabolismo, o fígado apresenta mecanismos efetores que podem contribuir para a direta eliminação do parasita de forma ainda não completamente compreendida. Assim, este estudo tem por objetivo analisar o papel dos hepatócitos e das células de Kupffer (CK) na infeção por L. infantum. A resposta imune orquestrada pelo cão contra L. infantum é constituída por um largo espetro de respostas de imunidade inata e adquirida. Estudos em cães infetados demonstraram que a imunidade ao parasita é órgão-específica. Para analisar a interação entre L. infantum e os hepatócitos, no presente estudo, hepatócitos e CK foram isolados de cães saudáveis e cultivadas em dois sistemas de cultura diferentes. O sistema 2D consiste na clássica cultura em placa e o sistema 3D tira partido da tendência dos hepatócitos para agregar e permite às células recriar a organização natural existente no órgão. L. infantum apresentou um claro tropismo para os hepatócitos, aderindo fortemente à membrana celular. No entanto, não é claro se o parasita entrou nos hepatócitos. Estas interações levaram a uma ativação da imunidade inata, aumentando a expressão génica dos receptores NOD1 e NOD2, bem como TLR2, em sinergia com a diferenciação de um perfil misto de citocinas anti- e pro-inflamatórias, que conduziu à diminuição de atividade das CYPs450. Três novos compostos com reconhecida atividade anti-leishmanial (ácido ursólico, chalcona-8 e quercetina) foram testados e comparados com o fármaco classicamente utilizado no tratamento da leishmaniose. Os compostos experimentais apresentaram boa atividade leishmanicida e não afetaram a viabilidade dos hepatócitos, diminuíram a inflamação celular e restauraram a atividade das CTPs450, havendo ainda a hipótese de serem metabolizados em parte pelas referidas enzimas. As CK mostraram-se permissivas a amastigotas e promastigotas e elevaram a expressão de NOD1 e TLR2 na presença do parasita. No entanto, L. infantum é capaz de regular a resposta imunitária nas CK, evitando a ação de citocinas anti e pró-inflamatórias e do stress oxidativo, aumentando, por outro, lado a síntese de ureia. A adição de antimoniato de meglumina permitiu às CK recuperar a ativação e expressão de recetores de imunidade inata e produção de citocinas. A co-cultura de CK infetadas com hepatócitos revelou que as células em conjunto foram capazes de ativar a imunidade inata. Os hepatócitos evidenciaram, assim, um papel interessante na orquestração de uma resposta imune sinergética com as CK contra L. infantum. Foram ainda observadas diferenças entre a resposta imune exibida por macrófagos do sangue (MØ) e CK infetados por L. infantum. A análise da memória linfocitária hepática, realizada em modelo murino de leishmaniose visceral, demonstrou que o tratamento com antimoniato de meglumina elevou os níveis de memória e o número de células efetoras, melhorando a resposta imunitária do fígado, salientando o seu papel como órgão imunitário. As proteínas recombinantes de L. infantum, LirCyp1 e LirSOD foram reconhecidas pelas células de memória de animais infetados e tratados, indiciando que estas proteínas podem vir a ser incorporadas numa vacina terapêutica ou profilática
Canine leishmaniasis (CanL) is a zoonotic disease caused by Leishmania infantum, a protozoan parasite transmitted by sand flies. The liver is a vital and major metabolic organ which also constitutes a L. infantum preferential target. Despite the complex metabolism, liver possesses effector mechanisms that can contribute to direct elimination of Leishmania in a not yet defined way. Thus, this study aimed to assess the role of hepatocytes and Kupffer cells (KC) in the canine liver infected by L. infantum. A wide spectrum of innate and acquired immune responses is orchestrated by the canine host when facing L. infantum infection. CanL infection studies have indicated that parasite immunity is organ-specific. In the present study, canine hepatocytes and KCs were isolated from healthy stray dogs and two different culture systems were used to analyze the interaction of L. infantum with hepatocytes. The 2D-culture system consists in the classical plate culture and the 3D-culture system takes advantage of the natural aggregation properties of hepatocytes and allows cells to recreate some of the natural tissue architecture. L. infantum exhibited evident tropism to hepatocytes and strongly attached to the cells in both cultures system. However, it was not clear if parasites entered the hepatocytes. These interactions lead to activation of innate immunity by increasing the gene expression of NOD1 and NOD2 receptors in synergy with the increase in TLR2 expression. TNF-α cytokine expression was increased creating a proinflammatory cellular microenvironment and, as consequence, decreasing the CYP450 activity. This downregulation of CYPs may increase toxicity of clinical drugs in some cases. Three new potential leishmanicidal drugs were tested, ursolic acid, chalcone-8 and quercetin in comparison to the standard meglumine antimoniate. Experimental drugs revealed good leishmanicidal activity and did not reduce hepatocyte viability. The addition of leishmanicidal drugs decreased the inflammation and restored the CYP450 activity, which were also probable involved in the metabolization of the tested compounds. Regarding KCs, these cells were permissive to L. infantum amastigotes and promastigotes. KCs increased expression of NOD1 and TLR2 innate immune receptors. Even so, the parasite regulates KC immune response, avoiding the generation of proand anti-inflammatory cytokines and the oxidative burst, increasing the synthesis of urea. The addition of meglumine antimoniate allowed KC to activate, increasing the expression of innate immune receptors and of pro-inflammatory cytokines, breaking the silencing imposed by the parasite. The addition of L. infantum infected KCs to canine hepatocytes in a co-culture, was able to activate cells innate immunity. Hepatocyte seemed to have an interesting role in orchestrating a synergistic immune response against L. infantum parasites. Major differences were also found between the immune response exhibited by blood derivate macrophages (MØ) and liver KC, when facing infection by L. infantum. The assessment of the liver lymphocyte memory performed in the murine model of visceral leishmaniasis demonstrated that the treatment with antimoniate meglumine increases the levels of memory and effector T cells, enhancing liver immune response. The liver has higher levels of immune memory T cells, evidencing its role as an immunological organ. The recombinant proteins LirCyp1 and LirSOD, are strongly recognized by memory cells from infected and treated mice, indicating these proteins might be used in a prophylactic or therapeutic vaccine formulation.
URI: http://hdl.handle.net/10362/20432
Designação: Doutoramento no ramo de Ciências Biomédicas especialidade de Biologia Celular e Molecular
Aparece nas colecções:IHMT: MM - Teses de Doutoramento

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