Improved nucleic acid testing strategies to detect and discriminate veterinary relevant Mycobacterium tuberculosis complex members

Abstract

Os membros do complexo Mycobacterium tuberculosis (MTC) são agentes causadores de tuberculose em humanos e animais. A tuberculose bovina tem sido sujeita nas últimas décadas a programas de erradicação bastante dispendiosos, na maioria dos países desenvolvidos, envolvendo a análise laboratorial de tecidos de animais suspeitos para a detecção dos membros do MTC, nomeadamente Mycobacterium bovis. O diagnóstico definitivo é obtido através da cultura bacteriológica, o que pode levar 6-12 semanas, período durante o qual a carcaça do animal suspeito e a exploração de origem permanecem sob embargo sanitário. Neste trabalho, descreve-se um protocolo de extracção de DNA de fácil utilização adaptado aos tecidos, o qual é acoplado a um semi-nested PCR em tempo real, utilizando como alvo a IS6110, por forma a melhorar a detecção directa de bactérias pertencentes ao MTC em animais, abreviando o período necessário ao diagnóstico. O ensaio foi avaliado num grupo de 128 amostras de tecido provenientes de bovinos, javalis, veados e raposas. O desempenho global do teste corresponde a uma sensibilidade e especificidade de diagnóstico de 98,2% e 88,7%, respectivamente. Foi observado um coeficiente kappa de 0,859 entre o ensaio de semi-nested PCR e a cultura bacteriológica. Este ensaio permite a detecção rápida de micobactérias tuberculosas em amostras de animais com alta sensibilidade e especificidade, sendo acessível e de baixo custo para uma utilização num laboratório de diagnóstico veterinário. As espécies do MTC são geneticamente muito semelhantes, mas podem divergir na sua epidemiologia, nomeadamente na distribuição geográfica e preferência pelo hospedeiro, factores de virulência e padrões de susceptibilidade antimicrobiana. No entanto, o diagnóstico laboratorial convencional não diferencia rotineiramente as espécies do MTC. Foi desenvolvido um algoritmo de identificação rápido e robusto, baseado em PCR em tempo real, dirigido para cinco alvos genómicos para a identificação das espécies do MTC vulgarmente associadas à tuberculose nos bovinos e outros animais. O primeiro passo permite a confirmação dos membros do MTC nas culturas, através da detecção da IS6110, ou como uma espécie micobacteriana, pela presença do 16S rDNA. Se uma espécie do MTC for identificada, o segundo passo do algoritmo permite avaliar a presença ou ausência das regiões genómicas RD1, RD4 e RD9. O padrão correspondente permite inferir a espécie do isolado como M. tuberculosis (se todas as RDs estiverem presentes), M. caprae (se apenas a RD1 e RD4 estiverem presentes) ou M. bovis (se apenas a RD1 estiver presente). O algoritmo de identificação desenvolvido demonstrou um coeficiente kappa de 0,970 com o resultado da análise bacteriológica. O ensaio pode ser implementado em laboratórios de diagnóstico veterinário, especialmente em laboratórios de referência. Tem-se registado uma procura crescente por métodos de diagnóstico de doenças infecciosas rápidos, de fácil utilização e acessíveis, passíveis de serem utilizados em pontos-de-decisão. A detecção dos membros do MTC é geralmente realizada por diversos métodos convencionais baseados na cultura, que normalmente necessitam de oito semanas. Foram também desenvolvidas estratégias de diagnóstico molecular, mas a maioria requer operadores qualificados e equipamentos e infra-estruturas sofisticadas. Recentemente, a técnica de Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) mostrou-se promissora para o desenvolvimento de testes rápidos, de baixo custo, sensíveis e específicos para a detecção de agentes patogénicos. Neste trabalho, foram optimizados dois sistemas LAMP em formato duplex (dLAMP) para a identificação do MTC e Mycobacterium tuberculosis, e do MTC e M. bovis, apresentando valores de sensibilidade e especificidade comparáveis a outras abordagens em que se utiliza o PCR convencional. Os resultados das amplificações são avaliados colorimetricamente utilizando dispositivos de fluxo lateral, simples e comercialmente disponíveis, para a detecção de ácidos nucleicos (NALF). Os resultados apresentados nesta dissertação contribuem para a melhoria das estratégias de diagnóstico molecular existentes no combate à tuberculose animal.